高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定人血清8種葉酸循環(huán)代謝物

李慧敏，刁嘉茵，鄭康帝，張 召,3，林炳耀，林東子*（.東莞市濱海灣中心醫(yī)院，廣東東莞 53900；.廣東省人體微生態(tài)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 5000；3.廣東南芯醫(yī)療科技有限公司，廣東廣州 5000；.佛山市第四人民醫(yī)院，廣東佛山 58000）

葉酸及其衍生物5-甲酰四氫葉酸（5-FoTHF，亞葉酸）、5-甲基四氫葉酸（5-MeTHF）、5,10-亞甲基四氫葉酸（5,10-CH2-THF）和四氫葉酸（THF）等主要影響DNA 合成和DNA 甲基化兩個(gè)過(guò)程[1-2]，可以治療貧血及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也可以用作早孕期間預(yù)防胎兒畸形[3-9]。在尿嘧啶脫氧核苷酸（dUMP）到胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP）的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，dUMP 因葉酸缺乏導(dǎo)致積累，錯(cuò)誤摻入DNA，進(jìn)而在DNA 復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中誘發(fā)基因突變、DNA 單雙鏈斷裂、染色體斷裂等各種遺傳異常[10-11]。葉酸攝入不足將影響同型半胱氨酸（Hcy）代謝途徑，導(dǎo)致DNA 和RNA 甲基化異常及改變基因表達(dá)，從而引發(fā)各類相關(guān)疾病的發(fā)生[12-13]。隨著生活水平的不斷提高、三胎政策的放開(kāi)、出生率的降低等一系列因素，葉酸檢測(cè)已成為母嬰階段的重要檢測(cè)指標(biāo)。目前，臨床葉酸檢測(cè)多以化學(xué)發(fā)光法為主，常單獨(dú)測(cè)試葉酸及同型半胱氨酸，主要因?yàn)榇朔椒ň哂凶詣?dòng)化程度高、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，但化學(xué)發(fā)光法無(wú)法對(duì)葉酸代謝中的多種衍生物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)[15-16]。為協(xié)助臨床醫(yī)生明確患者葉酸缺乏的原因，探究葉酸檢測(cè)指標(biāo)豐富、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、葉酸上下游產(chǎn)物共檢等要求已成為該領(lǐng)域的難點(diǎn)。本文基于液相串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)葉酸代謝過(guò)程中的多種關(guān)鍵化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，以期為臨床上葉酸缺乏相關(guān)癥狀的診治提供參考。

1 資料和方法

1.1 儀器試劑

島津LC-20AC 型液相色譜儀；島津CL8050 型質(zhì)譜儀；乙腈、甲酸銨和甲酸（St.Lous,美國(guó)）；去離子水（Millipore、MA、USA）；葉酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF 標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)買自Sigma-Aldrich 上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度均大于98%。

1.2 方法

1.2.1 校準(zhǔn)品、質(zhì)控品及提取試劑配制（1）PBS 緩沖液：稱取磷酸二氫鉀0.24 g，磷酸氫二鈉1.44 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，加入去離子水約800 mL 充分?jǐn)嚢枞芙猓缓蠹尤霛恹}酸調(diào)pH 至7.4，定容至1 L即得。（2）牛血清白蛋白溶液：稱取適量牛血清白蛋白，按50 g/L 加入PBS緩沖液溶解，混勻即得。（3）三聯(lián)抗氧化劑：稱取抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇（DTT）適量，加入甲醇，分別配制成1 g/L 甲醇溶液，然后按抗壞血酸:檸檬酸:DTT:水=1:1:1:7 配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的三聯(lián)抗氧化劑。（4）儲(chǔ)備液配制：稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品葉酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF、5,10-CH2-THF、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和Hcy，分別加入三聯(lián)抗氧化劑，配制成1 g/L的各儲(chǔ)備液。（5）混合內(nèi)標(biāo)溶液配制：取葉酸內(nèi)標(biāo)和Hcy儲(chǔ)備液，用三聯(lián)抗氧化劑稀釋成葉酸內(nèi)標(biāo)為1 g/L，Hcy為20 g/L 的混合內(nèi)標(biāo)溶液。（6）校準(zhǔn)品的配置：先將各儲(chǔ)備液配制成梯度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按混標(biāo):牛血清白蛋白溶液=1:99 配制成如下質(zhì)量濃度校準(zhǔn)品，見(jiàn)表1。（7）質(zhì)控品的配置：先將各儲(chǔ)備液配制成2個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按混標(biāo):牛血清白蛋白溶液=1:99配制成如下濃度質(zhì)控品，見(jiàn)表2。（8）提取液配置：提取液1為配制含100 mg/L抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇的甲醇溶液；復(fù)溶液2為配制含100 mg/L 抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇的10%乙腈溶液。（9）前處理方法：取100～200 μL 樣本（血清、校準(zhǔn)品或質(zhì)控品）至EP 管中，加入5 μL 混合內(nèi)標(biāo)溶液和500 μL 提取液1 后渦旋振蕩1 min，混勻。離心后轉(zhuǎn)移400～500 μL 上清于96 孔進(jìn)樣板中。氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 復(fù)溶液2，覆上鋁箔封膜，檢測(cè)備用。將96 孔進(jìn)樣板放入自動(dòng)進(jìn)樣器中，準(zhǔn)備上機(jī)。

表1 8種人體葉酸循環(huán)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的配置信息（C1-C6為標(biāo)曲的6個(gè)質(zhì)量濃度，μg/L）

表2 8種人體葉酸循環(huán)代謝物質(zhì)控品的配置信息（μg/L）

1.2.2 測(cè)定方法（1）色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈溶液。流速450 μL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，洗脫梯度見(jiàn)表3。（2）質(zhì)譜條件：在電噴霧離子正離子檢測(cè)模式下，采用MRM (Multi Reaction Monitoring)掃描分析，離子源參數(shù)霧化氣流量為3 L/ min，干燥氣流量為2 L/min，加熱氣流量為15 L/min。DL 管(Dashlaunch)溫度為100～400 ℃，接口溫度為100～400 ℃，加熱塊溫度為100～400 ℃，碰撞誘導(dǎo)裂解氣壓為100～300 kPa，前體與產(chǎn)物離子通道見(jiàn)表4。

表3 8種人體葉酸循環(huán)代謝物流動(dòng)相洗脫信息

表4 8種人體葉酸循環(huán)代謝物液質(zhì)檢測(cè)前體與離子碎片信息

1.2.3 方法學(xué)探究 低、中、高濃度的質(zhì)控樣本分別在提取前和提取后加入內(nèi)標(biāo)，按樣品處理方法進(jìn)行樣本提取與上機(jī)檢測(cè)，分析方法的精密度。同一樣本平均分成6 份，前3 份每份按樣本提取方法提取后分別加入低、中、高濃度的內(nèi)標(biāo)作為組1 質(zhì)控樣本上機(jī)檢測(cè)；后3 份每份分別加入低、中、高濃度的內(nèi)標(biāo)按提取方法提取后作為組2質(zhì)控樣本上機(jī)檢測(cè)回收率。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)曲線性范圍與檢測(cè)限

8種人體葉酸循環(huán)代謝物的總離子流圖譜見(jiàn)圖1。各葉酸循環(huán)代謝的線性相關(guān)系數(shù)為0.994～0.999，表明線性關(guān)系良好，最低檢出限為0.128 μg/L。采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，葉酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF、5,10-CH2-THF 均共用葉酸內(nèi)標(biāo)。SAM、SAH 和Hcy 共用Hcy 內(nèi)標(biāo)。以校準(zhǔn)品待測(cè)物峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（y），以各校準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合后，相關(guān)系數(shù)r＞0.99。此外質(zhì)控品測(cè)試準(zhǔn)確度符合85%～115%，各個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)限及定量限如表5所示。

表5 8種人體葉酸循環(huán)代謝物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、準(zhǔn)確度及檢測(cè)線

圖1 8種人體葉酸循環(huán)代謝物總離子流圖譜

2.2 精密度與準(zhǔn)確度

由表6 可知，8 種人體葉酸循環(huán)代謝物精密度RSD 值為3.9%～12.3%，回收率RSD 值為85.4%～113.1%，精密度良好，回收率較高，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度良好。

表6 8種人體葉酸循環(huán)代謝物的精密度及回收率

2.3 樣本檢測(cè)結(jié)果

分別取兒童、孕婦志愿者樣本各50份，按1.2.1方法處理后，測(cè)定葉酸循環(huán)代謝產(chǎn)物含量，結(jié)果范圍如表7所示。

表7 樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討論

葉酸是促進(jìn)機(jī)體健康的重要物質(zhì)，是人體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的必須物質(zhì)，在造血系統(tǒng)中對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)和代謝有著重要的作用[17]。葉酸可以協(xié)助胎兒發(fā)育，預(yù)防胎兒神經(jīng)管畸形的發(fā)生，準(zhǔn)媽媽在備孕期間服用葉酸可大幅度降低胎兒神經(jīng)管畸形率[18]。同時(shí)，葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，對(duì)預(yù)防心血管疾病的發(fā)生具有重要的意義[13]。隨著生活水平的不斷提高、三胎政策的放開(kāi)，葉酸保健品的市場(chǎng)占有份額不斷增大，但由于缺乏科學(xué)的指導(dǎo)，葉酸使用現(xiàn)狀混亂。因此，通過(guò)檢測(cè)人體內(nèi)葉酸及其循環(huán)代謝物的真實(shí)狀態(tài)，針對(duì)性地調(diào)整、明確葉酸潛在需求，更符合個(gè)性化治療要求。

飲食攝入的葉酸主要以多聚谷氨酸鹽的形式，葉酸代謝首先在腸黏膜上水解，二氫葉酸轉(zhuǎn)移酶先是將葉酸還原為二氫葉酸，再生成四氫葉酸。四氫葉酸產(chǎn)生甲酰基、甲基、亞甲基等葉酸形式底物，亞甲基四氫葉酸經(jīng)甲基四氫葉酸還原酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸即是葉酸在血液的主要形式。當(dāng)前，臨床在進(jìn)行葉酸檢測(cè)分析時(shí)，不能明確全部葉酸循環(huán)代謝產(chǎn)物的含量，大大限制了醫(yī)生對(duì)患者葉酸缺乏的判斷。為此，臨床急需一種可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)人體葉酸循環(huán)代謝物的方法。檢測(cè)葉酸的主要方法為高效液相色譜法、時(shí)間分辨法、免疫化學(xué)發(fā)光法。免疫化學(xué)發(fā)光法穩(wěn)定性較好但特異性差，高效液相色譜法靈敏度高但穩(wěn)定性差，但這幾種方法均難以同時(shí)檢測(cè)多種葉酸循環(huán)代謝產(chǎn)物指標(biāo)[16]。

本文基于液相串聯(lián)質(zhì)譜全面對(duì)葉酸代謝過(guò)程中的多種關(guān)鍵化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，方法高效、靈敏，檢測(cè)下限較低，準(zhǔn)確度高，能對(duì)整個(gè)葉酸代謝水平進(jìn)行全面評(píng)估[19]，可滿足人體葉酸循環(huán)代謝物常規(guī)測(cè)定的要求，但其普適性有待進(jìn)一步的研究確定。