基于16S rDNA 測(cè)序的皮脂溢出患者腸道菌群分析

葉巧園，丁元林，朱 堅(jiān)，江浩波，王 琳* （.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東東莞 53808；.東莞東華醫(yī)院，廣東東莞 530）

皮脂溢出是指在前額、鼻部、頭皮、背部這些皮脂腺分布密集的部位油膩，其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，有研究認(rèn)為遺傳因素及雄激素水平增高是導(dǎo)致皮脂腺分泌增加的核心因素[1-3]。皮脂腺細(xì)胞具有促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、雄激素以及多種神經(jīng)肽的多種受體[4-5]，精神刺激、某些疾病如抑郁癥、腎上腺腫瘤會(huì)使機(jī)體的皮脂分泌明顯增加，糖尿病、動(dòng)脈硬化、肥胖、乳腺癌、高脂飲食也可令皮脂分泌增加。腸道菌群失調(diào)可引起雄激素水平變化、脂質(zhì)代謝紊亂，與肥胖、代謝綜合征、生殖、婦科腫瘤等疾病有極為重要的關(guān)系[6-9]。為了解腸道菌群失調(diào)與皮脂溢出的聯(lián)系，本研究基于16S rDNA 測(cè)序的技術(shù)手段，對(duì)皮脂溢出患者及健康對(duì)照人群腸道菌群進(jìn)行了初步分析。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

納入2019 年10 月-2020 年4 月東莞東華醫(yī)院皮膚科收治的皮脂溢出患者10 例（研究組），均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：面部皮膚和頭發(fā)多脂、油膩鱗屑增多，同時(shí)伴有脂溢性皮炎、痤瘡及毛囊炎；愿意配合研究收取合格的糞便標(biāo)本；在東莞市定居超過(guò)2 a。同期隨機(jī)抽取健康對(duì)照者10 例（對(duì)照組），均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)皮脂溢出癥狀，在東莞定居超過(guò)2 a。兩組均已排除以下人員：6 個(gè)月內(nèi)服用過(guò)糖皮質(zhì)激素、抗生素、益生菌、免疫抑制劑、維甲酸類藥物、中藥者；哺乳期者；吸煙酗酒者；惡性腫瘤或嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；腸道疾病患者；有胃及下消化道手術(shù)史者。研究組中，男6例，女4 例；年齡31～57 歲，平均（44.7±5.2）歲。對(duì)照組中，男6例，女4例；年齡34～58歲，平均（45.9±5.9）歲。兩組患者的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

1.2 主要儀器及試劑

CR 儀（美國(guó)Biorad 公司）、QuantiFluor TM-ST 定量?jī)x（美國(guó)Promega）、Qubit 3.0（美國(guó)Life Invitrogen）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Biorad 公司）、冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma）、核酸電泳儀（美國(guó)Biorad公司）、Illumina Hiseq 測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)SeqHealth）。AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（美國(guó)Axygen Biosciences）、溴化乙錠（上海生工）、50×TAE電泳緩沖液（上海生工）、FastPfu高保真酶（美國(guó)NEB）、Illumina基因組DNA文庫(kù)制備試劑盒（美國(guó)Illumina）。

1.3 糞便標(biāo)本采集及DNA 提取

受試人員在醫(yī)院用糞便收集器采集新鮮糞便樣本2～3 g，迅速放入-80 ℃環(huán)境中保存。采用CTAB或SDS 方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，并對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 16S rDNA 基因擴(kuò)增及高通量測(cè)序

根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對(duì)選定的V3-V4(上下游引物序列分別為5′-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）。參照電泳初步定量結(jié)果，對(duì)PCR 擴(kuò)增回收產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100 和Qubit 進(jìn)行質(zhì)檢，文庫(kù)質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)barcode 分配reads，獲取有效序列。運(yùn)用Mothur 軟件對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量控制、過(guò)濾、去除嵌合體，得到優(yōu)化序列。通過(guò)USEARCH 軟件對(duì)序列進(jìn)行分類單元（Operational Taxonomic Units）聚類，將序列相似度≥97%的序列歸為同一OTU，然后通過(guò)OTU 與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)OTU 進(jìn)行物種注釋。通過(guò)Alpha Diversity(α 多樣性分析)，Beta Di-versity(β 多樣性分析)，等數(shù)據(jù)分析手段，最終得到糞便菌群的物種豐度信息。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(雙側(cè))方法，對(duì)樣本有效序列的群落豐富度指數(shù)和群落多樣性指數(shù)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)分析

從研究人群中共獲得20 個(gè)糞便樣本進(jìn)行測(cè)序，其中研究組和對(duì)照組各10 個(gè)樣本。高通量焦磷酸測(cè)序共產(chǎn)生1 326 101條有效序列，其中，10個(gè)研究組樣本共獲得652 492 條有效序列(平均每個(gè)樣品序列數(shù)為65 249±381)。對(duì)照組10 個(gè)樣本獲得673 609 條有效序列(平均每個(gè)樣品序列數(shù)為67 361±359)。

將測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw PE）進(jìn)行拼接、質(zhì)控及去嵌合體。得到Q20，Q30均在90%以上，表明質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。通過(guò)Rarefaction Curve 及Shannon 曲線（圖1～3)，可以看出，樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。圖3 顯示研究組與對(duì)照組擁有856 個(gè)相同OTUs，研究組、對(duì)照組特有的OTUs 分別有35、60 個(gè)。

圖1 RarefactionCurve曲線

圖2 Shanno曲線

圖3 研究組和對(duì)照組之間的OTUs組成

2.2 腸道微生物α多樣性分析

α 多樣性指標(biāo)用于表征樣品內(nèi)的微生物群落多樣 性。α 多樣性指數(shù)包括Observed species、ace、Chao、Shannon 和Simpson 等5 個(gè)指數(shù)。反映群落豐富度的Observed species、ace 和Chao 指數(shù)，以及反映群落多樣性的Shannon 和Simpson 指數(shù)，研究組均低于對(duì)照組(P＜0.05)。表1 及圖4～7 顯示研究組比對(duì)照組的腸道菌群群落豐富度和多樣性均發(fā)生了一定變化。

表1 研究組和對(duì)照組α多樣性參數(shù)的比較

圖4 Observed_Species 指數(shù)

圖5 Shannon指數(shù)組間差異箱形圖

圖6 Chao1指數(shù)

圖7 PD_whole_tree指數(shù)

2.3 腸道微生物β多樣性分析

采用weighted UniFrac 指數(shù)衡量β 多樣性。β 多樣性分析(β diversity)是用來(lái)比較物種多樣性方面存在的差異大小。如果樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)。主坐標(biāo)分析PCoA 圖顯示，除個(gè)別樣本存在偏差，研究組和對(duì)照組基本呈現(xiàn)在不同區(qū)域（圖8）。

圖8 基于Weighted Unifrac距離的PCoA分析

2.4 研究組與對(duì)照組間的細(xì)菌種群差異

采用LefSe 分析法，進(jìn)一步探討各組間的分類區(qū)別。我們?cè)谘芯拷M和對(duì)照組發(fā)現(xiàn)了48 個(gè)差異顯著的種群，所有這些分類群的LDA 均大于2。與研究組樣本相比，健康組中的細(xì)菌類群較豐富，有26 條富集于健康組，20條富集于研究組（圖9）。

圖9 LefSe分析圖

2.5 門水平腸道菌群序列分類分析

在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）及擬桿菌門（Bacteroidetes）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，約占總序列數(shù)85%。研究組、對(duì)照組中腸道菌群物種豐度較高的厚壁菌門（Firmicutes，74.51%vs70.13%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，10.43%vs15.61%）、變形菌門（Proteobacteria，11.64%vs7.25% ）、放線菌門（Actinobacteria，3.31%vs3.11%）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究組中梭桿菌門（Fusobacteria）比對(duì)照組降低了84.5%（0.43%vs2.78%，P＜0.05）（圖10）。

2.6 科水平腸道菌群序列分類分析

在科水平上，螺旋藻科、瘤胃球菌科是相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，約占總序列數(shù)60%。與對(duì)照組相比，腸道菌群物種豐度較高的螺旋藻科（Lachnospiraceae，32.02%vs 32.11%）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae，28.61%vs26.26%）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。研究組擬桿菌科（Bacteroidaceae）降低了33.12%（7.46%vs11.12%）而腸桿菌科（Enterobacteriaceae）升高了36.65%（10.15%vs6.43%）（圖11）。

圖11 科水平物種差異

2.7 屬水平腸道菌群序列分類分析

在屬水平上，研究組糞桿菌屬（Faecalibacterium）升高了45.07%（18.25%vs12.58%），擬桿菌屬（Bacteroides）降低了32.91%（7.46%vs11.12%），而勞特氏菌屬（Blautia，10.09%vs9.95%）、羅斯氏菌屬（Roseburia，6.19%vs7.43%）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)（圖12）。

圖12 屬水平物種差異

2.8 種水平腸道菌群序列分類分析

在種水平上，研究組普拉氏梭桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）、活潑瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）、大腸桿菌（Escherichia coli）分別升高了45.07%（18.25%vs12.58%）、39.01%（3.35%vs2.41%）、155.12%（3.98%vs1.56%），而布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）下降了372.54%（0.51%vs2.41%）（圖13）。

圖13 種水平物種差異

2.9 PICUSt腸道菌群功能預(yù)測(cè)分析

采用PICUSt 軟件對(duì)16S 測(cè)序樣本中可能存在的各級(jí)KEGG 通路及豐度值進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究組有5 條通路與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖14），分別為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)、嘌呤代謝(Purine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）和癌癥中樞碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)。

圖14 差異通路圖

3 討論

人體是由自身器官和微生物組成的超級(jí)生物體，微生物與宿主共同進(jìn)化，并且與宿主之間不斷地進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流，其中約有80%的微生物存在于腸道，參與了腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、分布、代謝和排泄，微生物與宿主之間互相依存互相制約，處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。當(dāng)腸道菌群發(fā)生改變，可引起腸道吸收屏障的變化，引起腸道免疫系統(tǒng)的應(yīng)答異常，從而參與多種疾病的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸。腸道菌群根據(jù)對(duì)人體是否有益分為益生菌、有害菌。根據(jù)菌群代謝途徑的特點(diǎn)，擬桿菌和瘤胃球菌屬可主導(dǎo)蛋白質(zhì)和動(dòng)物脂肪的吸收，普氏菌屬可提高糖類飲食的吸收[10]。根據(jù)疾病的發(fā)病結(jié)果來(lái)看，高豐度的擬桿菌門和硬壁菌可引起能量過(guò)度吸收，引起肥胖。高豐度擬桿菌、瘤胃球菌促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)，而普拉梭菌、柔嫩梭菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸減少腸道炎癥反應(yīng)[11]。腸道益生菌減少，大腸桿菌增多，腸道革蘭陰性菌增多、腸道菌群豐度降低與胰島素抵抗有關(guān)[12]。

本文中，研究組的腸道菌群群落豐度和多樣性均低于對(duì)照組，在門、科、屬水平擬桿菌下降，表示腸道的蛋白質(zhì)、脂肪以及能量吸收較對(duì)照組低。研究組的厚壁門/梭桿菌比值發(fā)生變化，說(shuō)明皮脂溢出患者腸道處于病理炎癥狀態(tài)。但另外一方面普拉氏梭桿菌科升高，可產(chǎn)生較多短鏈脂肪酸，其中丁酸對(duì)腸道的有保護(hù)作用。閆慧敏等[13]對(duì)10 位重度痤瘡的青年患者（平均年齡24.4 歲）進(jìn)行16S 測(cè)序結(jié)果顯示厚壁門/擬桿菌比值正常，但產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌減少，與本研究結(jié)果恰好相反，這可能和選取的年齡階段不一致有關(guān)，提示不同年齡階段的皮脂溢出患者的發(fā)病原因不同。此外腸道內(nèi)擬桿菌、瘤胃球菌增高的患者體內(nèi)往往伴有更多的體內(nèi)脂肪含量、高胰島素血癥以及血清甘油三酯和游離脂肪酸增高，肥胖、糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，革蘭陰性菌增加可引起胰島素抵抗[14]。但本文結(jié)果相反，擬桿菌科下降，革蘭陰性菌明顯下降，提示不同基礎(chǔ)病的皮脂溢出患者代謝通路存在差異。

革蘭陰性菌豐度增加可產(chǎn)生大量的脂多糖，會(huì)引起腸黏膜通透性改變，產(chǎn)生內(nèi)毒素，引起肝細(xì)胞損傷，同時(shí)脂多糖激活TLRs通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，從而導(dǎo)致炎癥和纖維化，誘發(fā)肝硬化[15]。本文研究組的革蘭陰性菌（梭桿菌門、擬桿菌屬）顯著下降，說(shuō)明中年皮脂溢出患者的腸道中有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的革蘭陽(yáng)性菌群對(duì)肝臟有保護(hù)作用。但同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，研究組條件致病菌腸桿菌明顯增加，腸桿菌科主要參與糖代謝，通過(guò)兩條代謝途徑，一方面產(chǎn)生有機(jī)酸，如琥珀酸、乙酸、乳酸、甲酸；另一方面代謝產(chǎn)生內(nèi)生性的乙醇和丁二醇，對(duì)肝細(xì)胞有損傷作用。我們知道補(bǔ)充益生菌可抑制腸桿菌的滋生，所以我們推測(cè)中年皮脂溢出的患者，長(zhǎng)期口服益生菌可抑制體內(nèi)腸桿菌，保留了革蘭陽(yáng)性菌的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)影響腸道菌群分布，可能會(huì)起到保肝作用。

厚壁門/擬桿菌的比值改變，腸桿菌增多，可引起腸道的炎癥反應(yīng)，消化道功能紊亂可影響鋅、銅等微量元素吸收，當(dāng)體內(nèi)鋅含量下降時(shí),表皮脂類代謝障礙、表皮角化過(guò)度,皮脂分泌增多,同時(shí)嗜脂性糠秕馬拉色菌繁殖增加；角質(zhì)層屏障功能下降又會(huì)加重原有的皮脂溢出[16]。

我們采用PICUSt 軟件對(duì)16S 測(cè)序樣本中可能存在的各級(jí)KEGG 通路及豐度值進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究組有5 條通路與對(duì)照組存在差異，其中精氨酸和脯氨酸代謝通路也是抑郁癥患者的腸道菌群高頻代謝通路，說(shuō)明不良情緒在中年皮脂溢出得發(fā)病中起著重要作用。腸道菌群通過(guò)多種途徑與體內(nèi)支配胃腸道的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生相互作用，細(xì)菌通過(guò)直接或間接作用，參與合成激素和神經(jīng)遞質(zhì)“腦-腸”作用，具體參與的腸道細(xì)菌種類以及代謝機(jī)理，需要進(jìn)一步進(jìn)行更為深入的代謝產(chǎn)物檢測(cè)，采用大數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，以得出更為準(zhǔn)確、詳盡的研究結(jié)果。