口蝦蛄總生物堿對人非小細胞肺癌A549細胞增殖的抑制作用

齊相薇，蔡康榮，林榮文，王槐高 （廣東醫(yī)科大學.臨床技能培訓中心；.科研中心；3.病理生理學教研室，廣東東莞 53808）

原發(fā)性支氣管肺癌（簡稱肺癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌總發(fā)病率的85%左右[1]。NSCLC 細胞對放療和化療的敏感度相對較低，對于不能手術切除的癌癥患者，多數(shù)患者接受放化療后病情雖然得到局部控制，但只有少數(shù)患者能夠治愈[2]。隨著對NSCLC 相關驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn)，對NSCLC 患者的治療迎來了更個體化的靶向治療時代。在臨床應用中，靶向治療如何克服靶向藥物應用過程中出現(xiàn)的原發(fā)及獲得性耐藥問題，是其最大挑戰(zhàn)。確定基因突變患者的耐藥機制和非突變非小細胞肺癌患者的新治療方法仍然是一個需深入研究的領域[3]。因此，尋找高效、低毒的抗癌藥物對肺癌的防治及提高中晚期肺癌患者的生存質(zhì)量，也是肺癌防治研究的發(fā)展趨勢之一。海洋生物不僅具有獨特、新穎的結(jié)構(gòu)，而且具有強大的藥理活性，海洋來源的天然產(chǎn)物已經(jīng)成為抗腫瘤藥物的重要來源[4]。海洋生物堿是一類重要的海洋生物次級代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗炎和抗腫瘤等多方面的生物活性，是優(yōu)良的藥物先導化合物。研究證明，中國廣西北海潿洲島海域的陵水山海綿Mycale lingshuiensis中含有4個單吲哚生物堿[5]。有研究發(fā)現(xiàn)海洋生物堿Ropalladins 類似物對宮頸癌Caski 細胞有抑制增殖和誘導凋亡的作用[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)70 多個不同的Lamellarins 及與它們結(jié)構(gòu)類似的天然吡咯類生物堿，具有優(yōu)良抗腫瘤活性、多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性及抗菌活性，是醫(yī)藥發(fā)展領域潛在的候選藥物[7]。近年來本課題組研究發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄乙酸乙酯提取物與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥，增加了傳統(tǒng)化療藥物對肝癌細胞的毒性作用，呈現(xiàn)出低濃度拮抗，高濃度協(xié)同的作用[8]。本文結(jié)合前期的研究結(jié)果，通過改進提取方法得到口蝦蛄總生物堿，并觀察其對A549 細胞的增殖抑制活性，為進一步的開發(fā)應用提供實驗理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌A549細胞由廣東醫(yī)科大學腫瘤研究所提供。新鮮口蝦蛄（經(jīng)鑒定屬節(jié)肢動物門，甲殼綱，口足目，蝦蛄科品種）。RPMI 1640 培養(yǎng)基(GIBCO)，小牛血清(四季青生物材料工程公司)，Cell Counting Kit-8（CCK-8）（日本同仁株式會社化學研究所），DMSO(Sigma)；DMSO(Sigma)，細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 口蝦蛄總生物堿的提取

新鮮口蝦蛄絞碎，以水調(diào)入濃鹽酸浸泡過夜，離心后取上清液，調(diào)入濃氨水堿化至pH＞10。靜置過夜，離心后沉淀以乙酸乙酯萃取3 次，減壓濃縮沉淀，得到提取物即總生物堿。

1.3 CCK-8法檢測體外抗癌效果

選用對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞，培養(yǎng)24h，加入總生物堿使終質(zhì)量濃度分別為5、25、125、625 mg/L，培養(yǎng)48 h 后，進行CCK-8 實驗，于酶標儀上450 nm 波長處檢測各孔的光密度OD 值，按試劑盒說明，計算細胞增殖抑制率。抑制率%=（1－實驗組OD值/對照組OD值）×100%。采用Bliss法計算48 h各提取物的IC50值。

1.4 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力

取對數(shù)生長期A549 細胞，以400 個細胞/孔接種到6 孔板，培養(yǎng)24 h 后給予不同質(zhì)量濃度（0、50、100 mg/L）總生物堿處理，每組設3個平行孔，連續(xù)培養(yǎng)約2 周；用PBS 清洗細胞2 次，甲醇固定15 min 后，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，流水沖洗；將平皿倒置并疊加1 張帶網(wǎng)格的透明膠片，在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10 個細胞的克隆數(shù)，最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期分布

取對數(shù)生長期A549 細胞接種于6 孔板，待細胞長至合適滿度后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再給予不同質(zhì)量濃度（0、50、100 mg/L）總生物堿處理24 h，每組設3 個平行孔；收集細胞，加入預冷的70%乙醇固定，4 ℃過夜；離心后加入終質(zhì)量濃度為100 mg/L RNAase 和100 mg/L PI 染色液400 μL，混勻，室溫避光染色30 min；采用BD FACSCantoⅡ流式細胞儀進行檢測分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 18.0及Graph-pad prism 統(tǒng)計學軟件處理和分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用單因素方差分析及q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 口蝦蛄總生物堿對A549細胞生長的影響

作用24、48、72 h 后，口蝦蛄總生物堿對A549 細胞活性的抑制如圖1所示，呈時間-劑量效應關系降低A549 細胞的存活率。采用Bliss 算法軟件統(tǒng)計得到，其作用于A549 細胞24、48 和72 h 的IC50分別為（628.93±0.81）、（135.31±0.50）、（81.51±0.46）mg/L。

圖1 總生物堿對A549細胞增殖的抑制作用

2.2 口蝦蛄總生物堿對A549 細胞克隆形成能力的影響

口蝦蛄總生物堿（0、50、100 mg/L）作用2 周后，各組細胞克隆形成率分別為62%、38.25%、24.25%。隨著總生物堿質(zhì)量濃度的增加，A549 細胞克隆形成數(shù)目和克隆形成大小均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。表明口蝦蛄總生物堿呈時間-劑量效應關系抑制A549細胞的增殖。

圖2 總生物堿抑制A549細胞的克隆形成能力

2.3 口蝦蛄總生物堿對A549細胞周期的影響

與對照組相比，口蝦蛄總生物堿能誘導A549 細胞周期的G0/G1期比例由84%下降為59.8%,G2/M 期比例由2.27%上升為12.4%，呈時間-劑量效應關系,見圖3。

圖3 總生物堿對A549細胞周期分布的影響

3 討論

肺癌是肺部原發(fā)性腫瘤中最常見的類型。全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率、死亡率都極高且呈現(xiàn)上升趨勢。目前晚期NSCLC一線化療仍以含鉑雙藥方案為主，DDP+PEM/GEM 為優(yōu)選的基準方案，化療聯(lián)合EGFR-TKI/VGFR-TKI 均有獲益，化療后維持治療目前在臨床上也廣泛應用。EGFR 和RAS/MEK/ERK雙通路抑制聯(lián)合應用有望成為潛在的治療方式，有研究發(fā)現(xiàn)一線運用吉非替尼治療EGFR 敏感突變的晚期非小細胞肺癌療效優(yōu)于采用化療者[9]，而EGFR 靶點可能是鱗狀細胞肺癌治療的新方向[10]，但由于腫瘤耐藥性的產(chǎn)生[11]，迫切需要療效好、不良反應小和安全性高的抗NSCLC藥物。

豐富多樣的海洋生物及次生代謝產(chǎn)物，有著多樣性的結(jié)構(gòu)和豐富的生物活性，使其成為新藥研發(fā)中先導化合物的重要來源[12]。目前世界上廣泛使用的抗癌藥物中近半數(shù)源自海洋天然產(chǎn)物，如海鞘來源屬于生物堿類化合物的曲貝替定已經(jīng)上市，它在結(jié)構(gòu)上屬于四氫異喹啉類天然產(chǎn)物，其四氫異喹啉環(huán)能夠嵌入DNA 小溝并產(chǎn)生相互作用，從而誘發(fā)DNA 雙鏈斷裂導致細胞死亡，這意味著以往對紫杉醇及艾日布林耐藥的患者,以曲貝替定治療可能有不錯的效果[13]。目前尚有2 類生物堿來源的化合物（紅樹海鞘來源的Lurbinectedin 及河豚來源的替曲朵辛）已進入三期臨床相關抗腫瘤試驗[14]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)口蝦蛄乙醇提取物在體外能有效地抑制鼻咽癌CNE-2Z 細胞增殖的生長[15]，在體內(nèi)對CNE-2Z 裸鼠移植瘤的生長能具有一定的抑制作用[16]。但前期應用乙醇提取法及系統(tǒng)溶劑提取法所得的提取物，成分復雜且抗腫瘤活性物質(zhì)含量不高，故本文采用酸提堿沉法剔除部分雜質(zhì)，再采用乙酸乙酯萃取，以便提取成分更簡單的總生物堿。本文中，經(jīng)CCK8 法檢測，發(fā)現(xiàn)口蝦蛄總生物堿可以明顯抑制A549 細胞的增殖，作用48 h后IC50比以往方法的提取物更低。經(jīng)不同質(zhì)量濃度的口蝦蛄總生物堿作用2 周后，隨著總生物堿質(zhì)量濃度的增加，A549 細胞克隆形成數(shù)目和克隆形成大小均降低，提示口蝦蛄總生物堿呈時間-劑量效應關系抑制A549 細胞的增殖?？谖r蛄總生物堿能誘導A549 細胞周期的G0/G1期比例下降，而G2/M 期比例上升，并呈時間-劑量效應關系，表明口蝦蛄總生物堿能誘導A549細胞周期阻滯于G2/M期。

綜上所述，本文所采用的提取方法所得總生物堿體外抗腫瘤活性較高，其抑制A549 細胞增殖的機制可能是誘導了細胞周期阻滯，總生物堿的純化及體內(nèi)抗腫瘤活性仍需進一步實驗研究。