脫顆粒到單精子注射時間對ICSI周期臨床結(jié)局的影響

汪萌，朱麗霞，張旖旎，李舟，席青松，靳鐳

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430030)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)的出現(xiàn)為無數(shù)不孕癥夫婦帶來了福音。卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)通過將單個精子注射到成熟卵母細(xì)胞胞漿中，能有效解決男性因素引起的不孕癥，是輔助生殖領(lǐng)域具有重要意義的一項突破性技術(shù)[1]。雖然ICSI的操作流程已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，但是如何優(yōu)化卵母細(xì)胞脫顆粒到單精子注射時間，獲得更優(yōu)的妊娠結(jié)局仍需要進一步觀察和探索[2]。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為由于脫顆粒過程中透明質(zhì)酸酶以及機械吹打會損傷卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜，在脫顆粒操作后卵母細(xì)胞需要一段時間來恢復(fù)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[3]，因此在脫顆粒一段時間后進行單精子注射是合理的。此外，在單精子注射前培養(yǎng)卵母細(xì)胞可能會促使胞質(zhì)進一步成熟，從而使卵母細(xì)胞完全激活，獲得正常發(fā)育的潛能，可能會提高胚胎的受精率和臨床妊娠率[4]。但也有研究表明脫顆粒到單精子注射的時間與ICSI受精率負(fù)相關(guān)[5]，隨著時間間隔的延長，ICSI的受精率也會逐漸下降，因此推薦單精子注射應(yīng)當(dāng)在脫顆粒后盡快完成。然而還有部分研究認(rèn)為脫顆粒時間對胚胎發(fā)育以及臨床結(jié)局均無顯著影響[6-7]。

由于目前對于脫顆粒后多久進行單精子注射能夠獲得最優(yōu)結(jié)局尚未達(dá)成共識，因此本研究進行了一項回顧性研究，探索卵丘復(fù)合物脫顆粒到單精子注射時間對ICSI周期妊娠結(jié)局的影響，并試圖找到最佳的脫顆粒后ICSI操作時機以獲得最優(yōu)臨床結(jié)局。

資料與方法

一、研究設(shè)計及分組

1.研究對象：本研究為單中心回顧性研究。研究對象為2016年10月至2019年12月于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心第一次行ICSI治療的夫婦。

納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)新鮮采卵周期；(2)男方少、弱精子癥且精子優(yōu)化后密度仍小于5×106/ml；(3)女方無明顯異常或僅為輸卵管因素性不孕；(4)女方年齡<40歲；(5)女方采用標(biāo)準(zhǔn)改良長方案進行促排卵；(6)獲卵數(shù)多于4個；(7)男方手淫法取精。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)供卵或供精周期；(2)男方手術(shù)取精(包括睪丸穿刺取精、附睪穿刺取精、顯微取精等)；(3)夫妻雙方任何一方患有乙肝、結(jié)核等感染性疾??；(4)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測周期；(5)ICSI后受精失敗或低下的周期(受精率<25%)。

本研究已通過華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2.研究對象分組：根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入3 827個ICSI周期的數(shù)據(jù)。將卵丘復(fù)合物脫顆粒到單精子注射的時間定義為T，按照四分位數(shù)分為T1(T≤120 min，n=1 303)、T2(120 min210 min，n=846)4組。分析比較各組間的受精率、胚胎發(fā)育情況和臨床妊娠結(jié)局。

二、診療回顧

1.促排卵方案和取卵：所納入的周期均采用標(biāo)準(zhǔn)的改良長方案進行促排卵。在取卵周期的月經(jīng)第2天注射長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達(dá)必佳，輝凌，德國)3.75 mg進行降調(diào)節(jié)，注射藥物30 d后進行激素水平檢測和經(jīng)陰道B超監(jiān)測，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后，使用重組FSH(rFSH，果納芬，默克雪蘭諾，德國)進行促排卵，并根據(jù)卵泡監(jiān)測的結(jié)果調(diào)整用藥劑量。當(dāng)經(jīng)陰道B超監(jiān)測有2個或以上優(yōu)勢卵泡直徑大于18 mm時，肌肉注射重組HCG(艾澤，默克雪蘭諾，德國)10 000 U，36～38 h后經(jīng)陰道超聲下取卵。

2.卵丘復(fù)合物脫顆粒操作：配制80 U/ml的透明質(zhì)酸酶，將卵丘復(fù)合物置于預(yù)熱好的透明質(zhì)酸酶中，反復(fù)輕輕吹打，使顆粒細(xì)胞松散后，將卵母細(xì)胞移至G-MOPS plus緩沖液(Vitrolife，瑞典)中機械法繼續(xù)吹打去除卵丘顆粒細(xì)胞，直至完全去除顆粒細(xì)胞；再將去除了卵丘顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到G1 plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.ICSI操作：將優(yōu)化處理后的精子加到PVP溶液(Vitrolife，瑞典)中，調(diào)節(jié)操作針，在鏡下需選擇形態(tài)正常，特別是頭部形態(tài)正常的直線前向運動精子(長約60 μm，頭部呈卵圓形，長約4～5 μm)。將待注射的精子制動后，將制動的精子從尾部吸入注射針內(nèi)；用顯微固定針固定卵子，使卵子極體位于12點或6點位置；將精子推至注射針尖端，于3點位置將注射針垂直穿透透明帶及卵子胞膜進入胞漿，回吸可見卵膜破裂，部分胞漿和精子回流，隨后將回吸的胞漿與精子一起緩慢注入卵母細(xì)胞，盡可能減少PVP的注入量，最后退出操作針。

4.胚胎培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)評估：ICSI注射結(jié)束后的卵子在培養(yǎng)液中充分沖洗后移到預(yù)先平衡的G1 plus培養(yǎng)液中放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。授精后16～18 h(D1)在倒置顯微鏡下評估原核(pronuclei，PN)，能觀察到兩個原核(2PN)并在卵周隙中有兩個極體則說明正常受精，記錄各個卵子的PN數(shù)目。正常受精的卵子繼續(xù)培養(yǎng)至第3天(D3)，分別于D2、D3觀察并記錄胚胎的卵裂情況(包括卵裂球數(shù)目、形態(tài)、均勻程度、碎片情況)。第3天選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，剩余可利用胚胎轉(zhuǎn)移至G2 plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段，優(yōu)質(zhì)囊胚進行冷凍保存。

5.臨床結(jié)局[8-9]：本研究納入的所有移植周期均為D3新鮮胚胎移植周期。胚胎移植后14 d進行血清HCG檢測。胚胎移植5周后在超聲下能觀察到子宮內(nèi)孕囊及活動胎心則定義為臨床妊娠；確認(rèn)臨床妊娠后20周內(nèi)失去胎心則定義為流產(chǎn)；生化妊娠定義為HCG陽性但B超未見孕囊及胎心搏動。

三、評估指標(biāo)及定義

患者基線數(shù)據(jù)；IVF評估指標(biāo)，包括獲卵數(shù)、MⅡ率、2PN率、多PN率和卵裂率；妊娠結(jié)局評估指標(biāo)，包括生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和種植率。

各指數(shù)的計算方式如下：MⅡ卵率=MⅡ卵總數(shù)/獲卵數(shù)×100%；2PN率=D1出現(xiàn)2PN的卵總數(shù)/ MⅡ卵總數(shù)×100%；多PN率=D1出現(xiàn)多PN的卵總數(shù)/ MⅡ卵總數(shù)×100%；卵裂率=卵裂胚胎總數(shù)/D1出現(xiàn)PN的卵總數(shù)×100%；生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；種植率=孕囊個數(shù)/移植總胚胎數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、研究對象的臨床特征基線比較

本研究共納入2016年10月至2019年12月第1次于本中心行ICSI治療的3 827個周期。卵丘復(fù)合物脫顆粒到單精子注射時間T(min)的范圍為(0～450)min，呈偏態(tài)分布；眾數(shù)為120 min，中位數(shù)為160 min，四分位數(shù)分別為120 min、160 min和210 min。根據(jù)T值大小分為T1(T≤120 min)、T2(120 min210 min)4組。其中T1組1 303個周期，T2組641個周期，T3組1 037個周期，T4組846個周期。

納入的患者臨床特征包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、不孕年限及采卵到脫顆粒時間，各組間均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者臨床特征基線數(shù)據(jù)(-±s)

二、各組患者的ICSI結(jié)果比較

本研究比較了不同組患者的獲卵數(shù)、MⅡ率、正常受精率(2PN率)、多PN率以及卵裂率。各組間獲卵數(shù)以及卵裂率比較均無顯著差異(P>0.05)。隨著脫顆粒到單精子注射時間T的逐步延長，MⅡ率逐步升高，正常受精率也逐漸增加；其中T1組的MⅡ卵率相較于T4組顯著降低(P<0.05)，且T1組的2PN率相較于其他3組也顯著降低(P<0.05)。此外，隨著T時間的延長，多PN率也呈現(xiàn)上升趨勢，T3組相較于T1組的多PN率顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者ICSI結(jié)果比較[(-±s)，%]

三、各組患者的妊娠結(jié)局比較

本研究統(tǒng)計了新鮮移植周期的妊娠結(jié)局，主要妊娠結(jié)局包括生化妊娠率、臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率。納入的3 827個ICSI周期中，共有2 427個周期進行了D3新鮮周期胚胎移植，其中T1組838個周期、T2組393個周期、T3組642個周期、T4組554個周期。各組在單周期移植胚胎數(shù)目上無顯著差異(P>0.05)，且生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較均無顯著差異(P>0.05)。但是T1組的種植率顯著高于T3組(P<0.05)(表3)，提示脫顆粒到單精子注射時間過長可能會影響胚胎的種植潛能。

表3 新鮮周期移植的臨床結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

ICSI技術(shù)作為一種新型的體外受精技術(shù)主要用于男性因素不育或傳統(tǒng)IVF受精失敗患者。卵丘復(fù)合物脫顆粒以及單精子注射是ICSI操作中至關(guān)重要的步驟，對最終的臨床妊娠結(jié)局有著重要影響。但如何控制脫顆粒到單精子注射時間以獲得最優(yōu)臨床結(jié)局目前尚無統(tǒng)一定論。本研究回顧性分析了脫顆粒到單精子注射時間對ICSI周期妊娠結(jié)局的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵丘復(fù)合物脫顆粒到單精子注射時間會影響胚胎的種植潛能，合理地把握ICSI操作時機有利于提高胚胎種植機會，優(yōu)化IVF助孕結(jié)局。

本研究根據(jù)脫顆粒到單精子注射時間間隔，將納入人群分為4組，主要評估指標(biāo)為IVF結(jié)果以及臨床妊娠結(jié)局。IVF結(jié)果提示隨著脫顆粒到單精子注射時間間隔不斷延長，正常受精率(2PN率)也逐漸升高，這一結(jié)果與最近一項大樣本研究報道[3]一致，該研究中納入了1 468個ICSI周期，發(fā)現(xiàn)脫顆粒到單精子注射時間間隔與正常受精率之間存在正相關(guān)。造成這種現(xiàn)象的原因可能與卵母細(xì)胞的胞漿成熟相關(guān)。有文獻(xiàn)報道小鼠卵母細(xì)胞的核與胞漿的發(fā)育和成熟是不同步的，顆粒細(xì)胞會影響卵母細(xì)胞胞漿的成熟[10]，如果在卵母細(xì)胞胞漿成熟前進行ICSI，可能無法恢復(fù)減數(shù)分裂過程，從而無法形成原核導(dǎo)致受精失敗。然而，在正常生理條件下，排卵后的卵母細(xì)胞長時間不受精，卵母細(xì)胞的質(zhì)量會呈現(xiàn)時間依賴性的下降，表現(xiàn)為“卵母細(xì)胞老化”，這也是造成IVF/ICSI周期中胚胎發(fā)育潛能下降的最常見原因之一[11-12]。本研究結(jié)果也提示，脫顆粒到單精子注射時間間隔越長，胚胎的異常受精率(多PN率)也會逐漸上升。異常受精率上升也是卵母細(xì)胞老化的一種表現(xiàn)，是由于老化的卵母細(xì)胞在進行分裂時染色體滯留增加所致[13]。因此脫顆粒到單精子注射時間間隔過長或過短均不利于胚胎的發(fā)育。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著脫顆粒到單精子注射時間的延長，卵母細(xì)胞的MⅡ卵率也逐漸增加，這可能與單精子注射時間越晚，卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時間延長，部分處于MI期的卵母細(xì)胞可能在體外成熟，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率增高有關(guān)。

本研究將胚胎的妊娠結(jié)局作為主要結(jié)局指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)各組在生化妊娠率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率上并無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。但有趣的是，雖然隨著脫顆粒到單精子注射時間間隔的延長，受精率逐漸升高，但是胚胎的種植率反而下降。原因可能正如前文所述，如果卵母細(xì)胞沒有在一個合適的時間段內(nèi)受精，卵母細(xì)胞會繼續(xù)在輸卵管或者培養(yǎng)液中停留，從而發(fā)生卵母細(xì)胞老化最終影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能[14]；老化的卵母細(xì)胞會影響卵母細(xì)胞成熟相關(guān)因子的表達(dá)，從而最終影響后期胚胎的發(fā)育與種植潛能[15]。

本研究根據(jù)脫顆粒到單精子注射時間間隔(T)的四分位數(shù)，將各組進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于其他組，T1組(T≤120 min)的胚胎種植率顯著升高，提示如果控制此時間間隔在2 h以內(nèi)，可能有助于胚胎的著床。時間間隔越長，胚胎的種植能力可能會受損。Boldi等[16]發(fā)現(xiàn)將時間間隔控制在1 h以內(nèi)能獲得更高的優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和妊娠率。Zhang等[17]也發(fā)現(xiàn)將時間間隔控制在4 h以內(nèi)會獲得更好的臨床妊娠率。雖然本研究結(jié)論與這些結(jié)果大體上一致，但是脫顆粒細(xì)胞后進行單精子注射的最佳時間各研究仍不統(tǒng)一。本研究的結(jié)果顯示在卵母細(xì)胞脫顆粒后孵育一段時間后應(yīng)該盡快完成單精子注射操作，以獲得更好的妊娠結(jié)局。

本研究仍存在不足之處。首先本研究是一個單中心的回顧性研究，樣本量也有限；其次雖然各組移植胚胎數(shù)沒有顯著差異，但是單胚胎移植和雙胚胎移植的臨床結(jié)局可能會存在差異；另外本研究僅關(guān)注了脫顆粒到單精子注射這一段時間，而采卵到脫顆粒的時間也有可能對結(jié)果造成一定的影響。后續(xù)需要多中心、大樣本、前瞻性研究來驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，在ICSI周期中卵丘復(fù)合物脫顆粒到單精子注射時間可能會影響胚胎的種植潛能，合理地把握ICSI操作時機有利于提高胚胎種植機會，優(yōu)化IVF助孕結(jié)局。