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    艾迪注射液對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)制研究△

    2021-07-20 22:41:40陳溪雯錢亞云
    癌癥進(jìn)展 2021年9期
    關(guān)鍵詞:遷移率艾迪低濃度

    陳溪雯,錢亞云

    揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(揚(yáng)州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)/國(guó)家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室,江蘇 揚(yáng)州 225001

    胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,腺癌是其中最常見(jiàn)的病理類型。早期胃癌多無(wú)特殊癥狀,易被患者忽視,多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期,錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī),只能選擇放化療?;熕幬飳?duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)選擇特異性,在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)影響正常細(xì)胞的功能,不良反應(yīng)明顯,增加了患者的身心負(fù)擔(dān)。

    從中藥中尋找抗腫瘤活性成分逐漸受到臨床的重視,也是將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代科學(xué)相結(jié)合的重要方式。臨床研究及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明,艾迪注射液在提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤治療等方面的效果較好。

    雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase,MTOR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等多個(gè)方面均發(fā)揮至關(guān)重要的作用,能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞進(jìn)行修飾,包括增殖、分化、運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)?,使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤療法產(chǎn)生抗性。MTOR通路的異常激活可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡、轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)等方面,對(duì)艾迪注射液可能的分子機(jī)制進(jìn)行探討有重要意義。

    人胃癌HGC-27細(xì)胞源自未分化的胃癌組織,與其他分化程度的胃癌細(xì)胞相比,人胃癌HGC-27細(xì)胞惡性程度較高,未分化胃癌患者的預(yù)后差,這與艾迪注射液臨床適用條件相符。本文探討不同濃度的艾迪注射液對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其可能相關(guān)的信號(hào)通路,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

    野生型人胃癌HGC-27細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院研究所上海細(xì)胞庫(kù)。艾迪注射液購(gòu)自貴州益佰制藥股份有限公司,注射用順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司。兔抗人單克隆抗體β-actin、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)、MTOR、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)、磷酸化的4EBP1(phospho-4EBP1,p-4EBP1)均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling公司,兔抗免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司,胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司,噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自美國(guó)Corning公司,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。無(wú)菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自美國(guó)Costar公司;恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,蛋白電泳槽、全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠成像分析儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)儀購(gòu)自瑞士Roch公司,倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司,制冰機(jī)購(gòu)自德國(guó)Scotsman公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,并置于5% CO、37℃的無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)更換培養(yǎng)液,將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,采用胰酶細(xì)胞消化液將細(xì)胞消化進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌HGC-27細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10/孔,接種于96孔板,采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后,棄上清。分別加入 0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μl,分別作用24、48、72 h后,每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄上清。每孔加入150.0 μl的DMSO,低速振蕩10 min,采用多功能酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)量各孔吸光度(A)。

    1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌HGC-27細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞鋪滿后,于每孔中線處劃痕,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)沖洗3次,洗去漂浮細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察刮痕內(nèi)無(wú)細(xì)胞。0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液培養(yǎng)人胃癌HGC-27細(xì)胞48 h后,半數(shù)抑制濃度(50% concentration of inhibition,IC)為 20.17 mg/ml。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將6.0、12.0、24.0 mg/ml艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞分別設(shè)置為低濃度組、中濃度組、高濃度組,以野生型HGC-27細(xì)胞作為空白對(duì)照組,2.0 mg/L順鉑處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,于倒置相差顯微鏡下拍照記錄各孔劃痕的距離。細(xì)胞遷移率(%)=100%-未遷移率,未遷移率(%)=培養(yǎng)24 h空白面積/培養(yǎng)0 h空白面積×100%。

    1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期低濃度組(6.0 mg/ml)、中濃度組(12.0 mg/ml)、高濃度組(24.0 mg/ml)人胃癌HGC-27細(xì)胞,以及空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組人胃癌HGC-27細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10/孔,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)48 h后,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定濃度。經(jīng)過(guò)SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜90 min,采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h,加入一抗(濃度為1∶1000),4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗3遍,加入二抗(濃度為1∶2000),室溫孵育2 h,TBST清洗3遍,電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)法采集并分析圖像,計(jì)算AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞增殖能力的比較

    隨艾迪注射液濃度的升高,培養(yǎng)24、48、72 h,人胃癌HGC-27細(xì)胞A值均逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05);但60.0 mg/ml與120.0 mg/ml艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h時(shí)A值比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    >0.05)。(表 1)

    表1 不同濃度艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的A值比較(±s)

    2.2 細(xì)胞遷移能力的比較

    培養(yǎng)24 h,低濃度組、中濃度組、高濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率均高于空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05)。高濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率均高于低濃度組和中濃度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05),但低濃度組與中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    >0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率高于空白對(duì)照組,但低于中濃度組和高濃度組細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05)。(表2)

    表2 不同組別人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率比較(%,±s)

    2.3 AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

    低濃度組和中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞AKT、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組,且中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞MTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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    <0.05)。高濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于低濃度組和中濃度組,中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于低濃度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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    <0.05),但低濃度組和中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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    >0.05)。(表3)

    表3 不同組別人胃癌HGC-27細(xì)胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(±s)

    3 討論

    胃癌的發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率和病死率均較高,早期診斷率較低,根治性切除率和患者5年生存率也均較低。中醫(yī)藥是惡性腫瘤綜合治療的重要部分,主要目的是穩(wěn)定瘤體,改善患者的臨床癥狀、延長(zhǎng)生存期、提高生活質(zhì)量。艾迪注射液是常用的純中藥復(fù)方制劑,其主要成分中的人參、黃芪、斑蝥、刺五加有廣泛的生物活性。李瑞青采用艾迪注射液聯(lián)合化療治療62例老年晚期胃癌,結(jié)果顯示,與單純化療相比,中藥聯(lián)合化療能夠明顯緩解患者的癌因性疲乏程度,提高生活質(zhì)量,延長(zhǎng)生存期。劉沙河系統(tǒng)評(píng)價(jià)了艾迪注射液對(duì)緩解化療不良反應(yīng)的作用,結(jié)果顯示,艾迪注射液能有效減少化療患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)降低的風(fēng)險(xiǎn),減少外周神經(jīng)毒性反應(yīng),減少消化道不良反應(yīng)。

    本研究結(jié)果顯示,不同濃度的艾迪注射液處理人胃癌HGC-27細(xì)胞24、48、72 h后,細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制,呈現(xiàn)出濃度與時(shí)間的依賴性,表明艾迪注射液可明顯抑制HGC-27細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。艾迪注射液的主要成分為斑蝥,對(duì)正常細(xì)胞有一定毒性,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)置低濃度組、中濃度組、高濃度組,并研究其作用機(jī)制,希望在毒性較低的情況下,發(fā)揮最佳的抗腫瘤作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組細(xì)胞相比,艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞向空白處遷移的能力受到明顯抑制,表明艾迪注射液可能通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞的遷移發(fā)揮抗腫瘤作用。

    斑蝥是艾迪注射液的主要抗腫瘤成分,為加強(qiáng)斑蝥的抗腫瘤效果,減少毒性,又添加了益氣、活血的人參、黃芪、刺五加。艾迪注射液作為抗腫瘤藥物的分子機(jī)制尚未探明,但已有針對(duì)其成分的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。陳慕媛等研究發(fā)現(xiàn),去甲斑蝥酸鈉處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞后,p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)均下調(diào),提示去甲斑蝥酸鈉可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路,下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)蛋白的表達(dá),上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,BAX)和caspase 3蛋白的表達(dá)。陳佳欣等研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Compound K(CK)能夠抑制人肝癌細(xì)胞BEL-7404的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,下調(diào)AKT/MTOR通路相關(guān)蛋白AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR的表達(dá),表明人參皂苷CK可以通過(guò)調(diào)控AKT/MTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7404的自噬。

    MTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條酪氨酸激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)通路,是細(xì)胞生存通路之一。AKT是磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)下游的主要分子,活化的AKT能夠磷酸化下游的多種蛋白,如核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、MTOR和p21基因等來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期和糖代謝。MTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,由MTORC1和MTORC2兩種多蛋白復(fù)合物構(gòu)成。MTORC1的主要功能是通過(guò)激活和磷酸化下游分子4EBP1來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。AGC激酶由cAMP依賴的蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase,PKA)、cGMP依賴的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)和磷脂依賴的蛋白激酶C(phospholipid-dependent protein kinase C,PKC)組成。研究表明,MTORC2能夠磷酸化AGC激酶家族中AKT的C端疏水模體,對(duì)生長(zhǎng)因子信號(hào)作出響應(yīng)。兩種復(fù)合物相互調(diào)節(jié),從而促進(jìn)蛋白合成、生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。

    為進(jìn)一步研究艾迪注射液的抗腫瘤作用機(jī)制,本研究觀察了MTOR信號(hào)通路在其中的作用,結(jié)果顯示,不同濃度艾迪注射液處理后的HGC-27細(xì)胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低。表明艾迪注射液可能通過(guò)抑制MTOR信號(hào)通路活化,發(fā)揮抗腫瘤作用。

    綜上所述,艾迪注射液可能通過(guò)抑制AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1等MTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用。但腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制較為復(fù)雜,艾迪注射液是否還通過(guò)其他途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,尚有待后續(xù)研究。

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