山蘭種子無菌繁殖研究進(jìn)展

牟涵 李書翔 楊潔婷 黃碩 趙佳鑫 張忠寶

摘 要：本文從外植體的消毒、培養(yǎng)基的選擇、植物生長調(diào)節(jié)劑配方、種子萌發(fā)形態(tài)變化、防治褐化方法、外源添加物質(zhì)等方面綜述了目前山蘭種子無菌繁殖的研究進(jìn)展，并對未來山蘭組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分析與展望。

山蘭[Oreorchis patens（Lindl.）Lindl.]是蘭科山蘭屬多年生草本植物，分布于我國西南、華中、西北、東北各地，日本、朝鮮半島至西伯利亞也有分布，干燥球莖入藥，甘、辛、寒、有小毒，具有滋陰清肺、化痰止咳的功效，用于癰疳、瘡腫、瘰疬、無名腫毒[1]，亦作山慈菇入藥[2]。目前自然條件下的山蘭，只能利用其假磷球莖分生繁殖，繁殖系數(shù)低，每年只能分化出1～2子球[4]。難以滿足市場的需求，而有性繁殖至今沒有成功的報道。因此導(dǎo)致其商品價格上漲，野生資源遭到極大破壞。為實現(xiàn)山蘭的集約化、規(guī)模化生產(chǎn)，提高繁殖系數(shù)、降低生產(chǎn)成本，不少學(xué)者開展了山蘭組培繁殖的研究，為山蘭的生產(chǎn)繁殖和野生資源的保護(hù)提供了重要的理論基礎(chǔ)，具有重要的參考價值。

1 消毒方法

不同的外植體材料所選用的消毒方法和消毒時間不同。山蘭種子通常的消毒步驟：洗衣粉浸泡5～10min，蒴果置于流水下沖洗數(shù)小時，后至少利用兩種類型的消毒劑進(jìn)行消毒、清洗。蒴果在清洗時應(yīng)保證其完整性，破裂的蒴果不能作為實驗材料。張正海等在研究關(guān)于山蘭種子無菌萌發(fā)時[3]，流水浸泡蒴果8h，采用了75%的酒精和0.15%氯化汞組合進(jìn)行蒴果的消毒處理，種子的萌發(fā)效果較好，污染低。在類似實驗研究中，為探究獨蒜蘭種子的最佳消毒組合時，李斌等[5]發(fā)現(xiàn)用75%的酒精和0.1%氯化汞組合消毒時，效果較佳，種子污染率低至26%。王躍華[8]等在關(guān)于杜鵑蘭種子快速萌發(fā)的研究中表明，杜鵑蘭0.1%升汞消毒最佳時間為6min，此時種子的染菌率低（15.6%），而存活率高（95.7%）。因此，結(jié)合其他的研究結(jié)果，山蘭種子消毒劑組合以升汞+酒精較好，較常見的組合消毒劑還有升汞+次氯酸鈉，同時山蘭種子消毒需要把握好時間，時間過長易導(dǎo)致種子死亡而無法萌發(fā)。

2 培養(yǎng)基的選擇

2.1 山蘭基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是外植體材料賴以生存和發(fā)展的營養(yǎng)基礎(chǔ)。不同種類、不同植物部位組織，對營養(yǎng)的要求都不盡相同，因此篩選合適的培養(yǎng)基，是植物組織培養(yǎng)極為重要的內(nèi)容。目前山蘭組織培養(yǎng)最為常見的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。2015年張正海、張悅等[6]用MS、B5和White三種培養(yǎng)基，就含鹽量和高壓滅菌對培養(yǎng)基酸堿度的影響問題進(jìn)行實驗研究，結(jié)果表明培養(yǎng)基酸堿度緩沖能力隨含鹽量增加而增加。山蘭種子的萌發(fā)需要長達(dá)60～70d的時間，故選擇無機鹽含量高且酸堿度緩沖能力強的MS培養(yǎng)基。

2017年張海正等[6]在探究MS培養(yǎng)基鹽含量對山蘭種子萌發(fā)的影響時，發(fā)現(xiàn)種子在MS、1/2MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率顯著高于

1/4MS培養(yǎng)基，且MS、1/2MS培養(yǎng)基之間萌發(fā)數(shù)的差異不大。

2.2 山蘭種子在MS固體培養(yǎng)基與MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的討論

張海正等[3]通過山蘭種子的組培實驗，詳細(xì)的記錄了山蘭種子萌發(fā)過程中形態(tài)變化的主要階段（從種子分化成胚細(xì)胞時開始詳細(xì)記錄）。先是種子包被在種皮內(nèi)，種子胚細(xì)胞吸水膨脹。進(jìn)而種子發(fā)育成心形胚，變成黃綠色，沖破種皮限制。隨后胚根開始分化根毛，分化出子葉和大量根毛，形成黃綠色的原球莖。后又分化成淺綠色的球莖。而白芨種子萌發(fā)時首先種胚吸水膨大，顏色轉(zhuǎn)綠，進(jìn)而突破種皮形成原球莖，原球莖長出葉片和根，部分原球莖轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶢钋o，最后成苗[9]?？傮w上看，山蘭種子與白芨種子在萌發(fā)階段與形態(tài)上有相似性，故在培養(yǎng)基的選擇，可參照白芨的培養(yǎng)基類型。

趙垚[10]等在分析白芨種子于MS固體培養(yǎng)基、MS液體培養(yǎng)基兩種介質(zhì)上萌發(fā)、生長的差異時發(fā)現(xiàn)，白芨種子用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，長達(dá)60天也無法形成典型的真根，但種子的萌發(fā)率優(yōu)于固體培養(yǎng)基，且有利于原球莖的增大。就MS的固體培養(yǎng)基而言，有真根的形成且根生長迅速。

綜上所述，山蘭種子可借鑒白芨的培養(yǎng)方案，在MS液體培養(yǎng)基中種子吸收營養(yǎng)水分，在短時間內(nèi)得到大量原球莖，后及時將大量原球莖分裝至MS固體培養(yǎng)基可得試管苗，經(jīng)煉苗、移栽最終形成大量山蘭幼苗。

3 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑用量雖小，但培養(yǎng)基卻培養(yǎng)基在的關(guān)鍵性物質(zhì)，是組織培養(yǎng)的“秘訣”。不同類型、不同配比關(guān)系、不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑對植物生長不同時期的生長分化都起著決定性調(diào)

節(jié)作用。張海正等[3]發(fā)現(xiàn)山蘭種子適宜萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L。且在此種條件下，山蘭的原球莖和橫走莖的發(fā)育誘導(dǎo)效果都不錯，而NAA含量降低利于原球莖分化，6-BA含量的增加利于橫走莖的分化。張海正等[7]發(fā)現(xiàn)，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分裂素TDZ、ZT、6-BA、KT作用于原球莖增殖時，6-BA效果相對較佳，且增殖效果有隨6-BA濃度增加呈先增大后降低的趨勢。生長素2，4-D、NAA、IBA、IAA作用于原球莖增殖時，NAA的增殖效果明顯。在6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L組合時原球莖增值效果最佳;分裂素ZT、6-BA、KT作用于原球莖分化時，原球莖分化為球莖效果最佳的是KT，且分化系數(shù)有隨KT濃度增加呈先增大后降低的趨勢。生長素IBA、IAA作用于原球莖增殖時，IBA原球莖分化為球莖效果較好。在KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L組合時原球莖分化效果最佳;在山蘭生根培養(yǎng)階段采用6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L的組合，其生根效果較佳，達(dá)6.6條/球莖。

總結(jié)來看山蘭組培激素配比方案，可參照以下結(jié)果：

萌發(fā)培養(yǎng)為MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L

球莖增值培養(yǎng)為6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L

原球莖分化培養(yǎng)為KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L

生根培養(yǎng)為6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L

4 討論與展望

目前關(guān)于山蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)的研究中，關(guān)于植物生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)條件的分析比較常見，但就培養(yǎng)過程中防治污染、褐化及添加外源物質(zhì)方面的資料較少。而親緣植物杜鵑蘭原球莖的抗褐化研究表明[15]，在五種抗褐化劑中，抗褐化效果依次為AC （300mg·L-1）>GSH（75mg·L-1）>Vc（50mg·L-1）>Na2S2O3（15 mg·L-1）>PVP（3000mg·L-1），此類研究，將對山蘭的組織培養(yǎng)中有一定的借鑒和啟示作用。

蘭科植物組培過程當(dāng)中利用較多的外源添加物質(zhì)常有蛋白質(zhì)、馬鈴薯汁、椰乳和香蕉汁等。這些物質(zhì)中含有一定量激素、氨基酸和維生素及其他營養(yǎng)物。研究發(fā)現(xiàn)，這類物質(zhì)對植物的組織培養(yǎng)有顯著的促進(jìn)作用。朱根發(fā)[11]等研究發(fā)現(xiàn)香蕉對酸堿有很強的緩沖能力，對植物的生長和增殖具有促進(jìn)作用，山蘭種子萌發(fā)周期較長，可加入香蕉汁，起到酸堿緩存的作用;李斌等[5]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入香蕉有助于獨蒜蘭種子萌發(fā)，二人的結(jié)論相符。石麗敏等[12]研究表明，蘭科種子萌發(fā)過程中不需要刻意加入外源物質(zhì)，蘭科藥用植物種子萌發(fā)完全依賴內(nèi)生真菌提供必要的碳源、氮源等多種營養(yǎng)物質(zhì)。而在生根壯苗的過程中可加入一定的蔗糖以補充碳源，促進(jìn)植物生長發(fā)育;孟肖[13]在培養(yǎng)基中添加番茄汁30g/L、馬鈴薯汁30g/L有助于白芨種子萌發(fā)并提高增殖率;李霖明[14]研究分析表明，椰汁含有某種特殊物質(zhì)有助于誘導(dǎo)根莖出芽、提高胚的萌發(fā)率。因此在山蘭組織的萌發(fā)培養(yǎng)中可適當(dāng)添加椰汁，促進(jìn)胚的萌發(fā)。在分化、生根培養(yǎng)階段加入適量的蔗糖、馬鈴薯汁或番茄汁以補充氮源、微量元素等。此外在培養(yǎng)基在加入活性炭，可以有效吸附植物體的分泌物及一些有毒物質(zhì)。此后的在山蘭組織培養(yǎng)研究中，可以進(jìn)一步的去探尋有機物質(zhì)在組織培養(yǎng)在中對植物萌發(fā)、增殖、分化、生長等方面的促進(jìn)作用。

朱楨煜等[4]將山蘭球莖一分為二、一分為四進(jìn)行組培繁殖，可以提高其繁殖系數(shù)。山蘭種子小、數(shù)量多，可以提供足夠的組培材料。對山蘭種子進(jìn)行組培繁殖將有效的提高其繁殖系數(shù)、實現(xiàn)短期內(nèi)獲取大量種苗的目標(biāo)、為其規(guī)?；⒓s化生產(chǎn)提供技術(shù)條件。山蘭種子組培技術(shù)的進(jìn)一步成熟，將有效的滿足市場需求，同時也將對野生資源的保護(hù)作出重要貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[2] 中國藥材公司.中國中藥資源志要[M].北京：科學(xué)出版社，1994： 1553.

[3] 張正海，張悅，張亞玉，等.山蘭種子無菌萌發(fā)及形態(tài)變化研究[J].特產(chǎn)研究，2017，39（02）：5-8.

[4] 朱禎煜，姚百寧，馬艷麗.長白山山蘭繁殖技術(shù)研究[J].南方農(nóng)機，2020，51（05）：20+30.

[5] 李斌，陳杰，葉鵬.獨蒜蘭離體快繁技術(shù)研究[J].湖南林業(yè)科技，2019，（04）：17-22.

[6] 張正海，張悅，李愛民，等.鹽含量和高壓滅菌對培養(yǎng)基酸堿度和凝固狀態(tài)的影響[J]..浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（10）：1757-1760.

[7] 張正海，張亞玉，孫海，等.山蘭萌發(fā)種子定向培養(yǎng)成苗技術(shù)研究[J].特產(chǎn)研究，2019，41（04）：53-56+67.

[8] 王躍華，陳芳，陳燕，等.杜鵑蘭種子快速萌發(fā)產(chǎn)生原球莖研究[J].種子，2020，39（09）：147-150.

[9] 張燕，黎斌，李思鋒.不同培養(yǎng)基上白芨的種子萌發(fā)與幼苗形態(tài)發(fā)生[J].西北植物學(xué)報，2009，29（8）：1584-1589.

[10] 趙垚，曹小勇，楊國鵬，等.白芨種子在3種介質(zhì)上萌發(fā)及生長比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021（04）：87-92.

[11] 朱根發(fā)，蔣明殿.大花蕙蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)[J]..廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（4）：36-38.

[12] 石麗敏，宋費玲，許巧賢，等.蔗糖濃度對白芨種子培養(yǎng)的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021（02）：297-298+338.

[13] 孟肖，陳娜，張皖秋，等.外源添加物對白芨種苗生長發(fā)育狀況的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020（12）：123-128.

[14] 李霖明，鐘云芳，宋希強，等.光照環(huán)境和天然椰汁對地寶蘭根狀莖生長與分化的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（19）：45-47+1.

[15] 葉睿華，呂享，李小蘭，等.五種抗褐化劑對杜鵑蘭原球莖增殖培養(yǎng)的作用效果[J].植物生理學(xué)報，2018，54（06）：1103-1110.