類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-35水平與其發(fā)病的相關(guān)性研究

李丹 石紅 孔祥紅 張景利

【摘 要】目的：探究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）分泌白細(xì)胞介素-35（IL-35）水平與其發(fā)病的相關(guān)性。方法：選取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者70例作為觀察組，健康體檢者70例為對照組。采集2組外周血，檢測Treg細(xì)胞數(shù)量、Foxp3熒光強(qiáng)度、IL-35水平。同時(shí)將觀察組患者按照28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分（DAS28評分）分為不同的組，對各組Treg細(xì)胞、Foxp3熒光強(qiáng)度、IL-35水平進(jìn)行檢測。結(jié)果：觀察組患者外周血中Treg細(xì)胞高于對照組，IL-35水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;

2組Foxp3熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。各DAS28評分組RA患者的Treg細(xì)胞、IL-35水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且DAS28評分越高，Treg細(xì)胞數(shù)量和IL-35水平越低;各DAS28評分組RA患者Foxp3熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量明顯上升，IL-35水平顯著下降。由于Treg細(xì)胞功能缺陷，降低了負(fù)調(diào)控能力。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;白細(xì)胞介素-35;相關(guān)性

The Correlation Between the Level of IL-35 Secreted by Treg Cells in Peripheral Blood and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis

LI Dan，SHI Hong，KONG Xiang-hong，ZHANG Jing-li

【ABSTRACT】Objective：To investigate the correlation between the level of IL-35 secreted by Treg cells in peripheral blood and the pathogenesis of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Seventy RA patients were selected as an observation group and 70 healthy physical examinees were selected as a control group.The peripheral blood of both groups was collected.The number of Treg cells，the fluorescence intensity of Foxp3 and the level of IL-35 were measured.At the same time，the patients in the observation group were divided into different groups according to the DAS28 score，and the Treg cells，F(xiàn)oxp3 fluorescence intensity and IL-35 levels in each group were detected.Results：The level of Treg cells in peripheral blood of the observation group was higher than that of the control group，and the level of IL-35 was lower than that of the control group（P < 0.05）;There was no significant difference in the fluorescence intensity of Foxp3 between the two groups（P > 0.05）.The difference of Treg cells and IL-35 levels in RA patients with different DAS28 scores was statistically significant（P < 0.05），and the higher the score of DAS28，the lower the number of Treg cells and IL-35 levels;There was no significant difference in the fluorescence intensity of Foxp3 between RA groups with different DAS28 scores（P > 0.05）.Conclusion：The number of Treg cells in the peripheral blood of RA patients increased significantly，and the level of IL-35 decreased significantly.Because of the deficiency of

Treg cells，the negative regulation ability was reduced.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;

Treg cells of peripheral blood;IL-35;correlation

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）為常見的全身性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎。RA患者往往出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫痛、滑膜關(guān)節(jié)破壞，嚴(yán)重影響患者的正常生活。RA是造成勞動力喪失和致殘的一個重要原因。目前，RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確[1-2]。其中，CD4+T細(xì)胞亞群失衡、炎癥介質(zhì)異常表達(dá)等，對RA發(fā)病有重要的作

用[3-4]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的兩大功能，包括免疫無反應(yīng)性和免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)節(jié)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用，對RA的發(fā)病和進(jìn)展產(chǎn)生影響。白細(xì)胞介素-35（IL-35）主要由Treg細(xì)胞分泌，發(fā)揮必需的抑制作用，促使發(fā)揮Treg細(xì)胞最大抑制效應(yīng)。IL-35表達(dá)缺失，一定程度上影響Treg細(xì)胞的抑制功能。本文探究RA患者Treg細(xì)胞分泌IL-35水平，及與其發(fā)病的相關(guān)性，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2019年2月到2020年2月

在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院就診的RA患者

70例為觀察組，同時(shí)選取同期健康體檢者70例為對照組。觀察組男35例，女35例;年齡27～75歲，

平均（63.58±5.21）歲。對照組男36例，女34例;

年齡26～74歲，平均（63.25±5.46）歲。2組在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 按照1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn);②簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①妊娠或哺乳期婦女;②急慢性感染、腫瘤、冠心病、糖尿病、高血壓病等患者;③合

并嚴(yán)重并發(fā)癥者;④合并其他自身免疫性疾病者。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)方法

2.1.1 儀器與試劑 CD25-PE熒光單克隆抗體、人IL-35細(xì)胞因子檢測試劑盒、人淋巴細(xì)胞分離液、牛血清蛋白、酶標(biāo)儀（美國Becton Dickinson公司）等。

2.1.2 標(biāo)本采集 采集所有研究對象空腹靜脈外周血，抗凝處理后及時(shí)進(jìn)行檢測分析。外周血單個核細(xì)胞用人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，PBS清洗重懸，制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞。對血漿進(jìn)行離心操作，離心機(jī)以3000 r·min-1離心5 min，離心半徑5 cm，然后進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。使用流式上樣管，將100 μL外周血單個核細(xì)胞懸液、CD4和CD25單抗各6 μL加入后，混合均勻，放置20 min。將BD Cytofix/Cytoperm選取250 μL加入，混合均勻后，放置20 min。將BD Perm/WashTMbuffer加入其中，離心機(jī)以1500 r·min-1離心5 min，離心半徑6 cm，棄上清液，沾干，重復(fù)操作，清洗1次。細(xì)胞重懸，加入10 μL Foxp3抗體，放置0.5～1 h，重復(fù)操作，清洗2次。棄上清液，在磷酸緩沖鹽溶液中細(xì)胞重懸，進(jìn)行檢測分析。血漿IL-35水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測。

2.2 觀察指標(biāo) 觀察2組外周血中Treg細(xì)胞水平，即Treg細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞）占CD4+T細(xì)胞的百分比;比較觀察組不同28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分（DAS28評分）患者的Treg細(xì)胞水平，按DAS28評分 < 2.6分、2.6～3.2分、3.3～5.1分、> 5.1分分為4組;比較2組IL-35水平;比較RA患者不同DAS28評分組的IL-35水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示，采用

t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后進(jìn)行分析;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 2組外周血中Treg細(xì)胞表達(dá)、Foxp3熒光強(qiáng)度比較 觀察組外周血中Treg細(xì)胞表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;2組Foxp3熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3.2 2組外周血中IL-35水平比較 觀察組外周血中IL-35水平較對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05）。見表2。

3.3 各DAS28評分組RA患者基線資料、Treg細(xì)胞表達(dá)、Foxp3熒光強(qiáng)度及IL-35水平比較 各DAS28評分組RA患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。不同DAS28評分患者Treg細(xì)胞表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），

且DAS28評分越高，Treg細(xì)胞表達(dá)越低。不同DAS28評分患者Foxp3熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。不同DAS28評分患者IL-35水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且DAS28評分越高，IL-35表達(dá)水平越低。見表3。

4 討 論

RA常出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹等癥狀，隨著疾病的進(jìn)展，對關(guān)節(jié)組織造成破壞，影響患者的日常活動。RA發(fā)病年齡為40～60歲，患病率為0.32%～0.36%。一般認(rèn)為，RA與免疫耐受被破壞相關(guān)[6-7]。目前，RA的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。在健康人群CD4+T細(xì)胞中，外周血Treg細(xì)胞的比例為5%～10%。Treg細(xì)胞具有免疫負(fù)調(diào)控的作用，對機(jī)體自身免疫耐受的維持有重要的意義。Treg細(xì)胞的作用主要包括：①表達(dá)抑制性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3;②分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-2、IL-10等;③細(xì)胞直接接觸介導(dǎo)抑制。IL-35是IL-12的家族成員，機(jī)體中主要由Treg細(xì)胞產(chǎn)生IL-35。IL-12 P35亞基、P35亞基相同，IL-27 EBl3亞基、EBl3亞基相同。構(gòu)成IL-35亞基的包括EBl3亞基、P35亞基。有研究顯示，EBI3-P35-Fc融合蛋白抑制IL-17分泌、Thl7細(xì)胞分化，提升γ干擾素水平，促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞增殖，抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖，改善關(guān)節(jié)炎癥狀[8-9]。也有研究顯示，由于缺乏IL-35，Treg細(xì)胞的抑制功能也會下降[10-13]。有IL-35缺陷的Treg細(xì)胞，發(fā)揮控制增殖效果，IL-35會抑制CD4+和CD8+

T細(xì)胞[14]。

本研究顯示，相比健康人群，RA患者的Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P < 0.05），但Treg細(xì)胞分泌的IL-35比健康人群明顯更低（P < 0.05）。提示在RA患者中，IL-35表達(dá)下降。IL-35具有負(fù)向調(diào)控的作用，說明免疫耐受遭到破壞。處于免疫“無能”狀態(tài)下，RA患者Treg細(xì)胞表達(dá)上升，免疫負(fù)調(diào)控功能沒有發(fā)揮[15-16]。為進(jìn)一步研究相關(guān)情況，對RA患者不同DAS28評分進(jìn)行分組觀察，結(jié)果顯示，不同DAS28評分患者Treg細(xì)胞、IL-35水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;且DAS28評分越高，Treg細(xì)胞數(shù)量越低，IL-35水平越低。DAS28評分顯示RA病情活動度，DAS28評分越高，表示關(guān)節(jié)侵蝕較重，疾病活動度越高;DAS28評分越低，顯示病情緩解。在疾病活動期一定程度上抑制了外周血Treg細(xì)胞數(shù)量及功能，機(jī)體處于免疫激活狀態(tài)，降低了其負(fù)調(diào)控能力，IL-35表達(dá)水平也下降。DAS28評分越高，疾病活動度越高。在疾病恢復(fù)期，Treg細(xì)胞、IL-35功能提升，機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。RA病程與Treg細(xì)胞也有一定的相關(guān)性。有研究認(rèn)為RA患者外周血Treg細(xì)胞以及Treg細(xì)胞分泌IL-35減少，也有研究認(rèn)為沒有明顯變化[17-19]。出現(xiàn)差異的原因，可能是由于某些患者用藥物治療后，對自身抗原的免疫耐受重建，免疫功能改

善[20-23];也可能是不同病程、活動度的影響;也可能是試驗(yàn)樣本群的影響。

綜上所述，RA患者IL-35水平顯著下降，Treg細(xì)胞水平提升，Treg細(xì)胞及分泌的IL-35與其發(fā)生、發(fā)展可能相關(guān)。

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收稿日期：2021-03-09;修回日期：2021-04-21