外源海藻糖對NaHCO3脅迫下甘草幼苗生長調(diào)節(jié)及總黃酮含量的影響

柳福智，張迎芳，陳垣

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

隨著工業(yè)的發(fā)展，鹽堿化的土壤面積不斷增加。鹽堿化導(dǎo)致土壤鹽堿組分不斷積累［1］，鹽堿組分超標(biāo)對植物生長具有嚴(yán)重的抑制作用，會阻礙植物根系的生長，進(jìn)而導(dǎo)致植株無法正常生長［2］。植物適應(yīng)鹽堿脅迫需要植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)共同調(diào)控［3］，是一個非常漫長的過程。

甘草（Glycyrrhiza uralensis）是我國的大宗藥材，有“國老”之美譽(yù)［4］?！侗静菥V目》有言［5］：“諸藥中甘草為君，治七十二種乳石毒，解一千二百草木毒，調(diào)和諸藥有功。”在我國，甘草大部分生長在內(nèi)蒙、寧夏、甘肅和新疆等地［6］，甘肅甘草的主產(chǎn)區(qū)位于河西走廊地區(qū)。甘草具有生命力旺盛的根系，對鹽堿組分有一定的抗性。在長期的演進(jìn)過程中，演變成了對逆境條件的順應(yīng)激勵機(jī)制，可以在各種不利條件下生長，成為干旱半干旱地域的重要植物資源之一［7］。甘草除了具備極廣泛的藥用價值外，還具備極高的生態(tài)價值，是防治風(fēng)沙、水土流失的重要植物［8］。

海藻糖是一種可溶性非還原性糖，大量存在于低等植物、真菌和一些無脊椎動物體內(nèi)［9］。一些生物體抵抗和忍受惡劣外部環(huán)境的能力與它們體內(nèi)的海藻糖直接相關(guān)［10］，海藻糖有抗應(yīng)激作用和顯著的抗脫水功能，可以維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保持細(xì)胞膜的完整性［11］，有很強(qiáng)的非特異性保護(hù)功能。研究發(fā)現(xiàn)，小麥（Triticum aestivum）幼苗在高溫脅迫下，外源施加適當(dāng)濃度的海藻糖可增強(qiáng)小麥幼苗內(nèi)抗氧化物保護(hù)酶活性［12］，外源海藻糖可以增加低氮脅迫下烤煙（Nicotiana tabacum）葉片的葉綠素含量［13］，降低鹽脅迫下小麥幼苗的脯氨酸（proline，Pro）含量，提高根系活力［14］，在高鹽脅迫下外施海藻糖可以通過維持K+/Na+動態(tài)平衡，降低擬南芥中Na+的含量，減輕K+的損失，使得植株的抗鹽性有所提高［15］。大量試驗結(jié)果表明，生物體處于鹽害［14?15］、低溫［16?17］、干旱［18］和重金屬超標(biāo)［19］等惡劣環(huán)境下，施加適宜濃度外源海藻糖可以增強(qiáng)植株對逆境條件的耐受力和適應(yīng)力。然而關(guān)于外源海藻糖在NaHCO3脅迫下調(diào)控甘草幼苗生長的報道較少。為此，本研究采用甘草無菌苗為試驗材料，探討外源海藻糖對NaHCO3脅迫下甘草幼苗的生長量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、抗氧化保護(hù)酶的活性和甘草總黃酮含量的影響，優(yōu)選能緩解堿脅迫下甘草幼苗生長的最適海藻糖濃度，為在鹽堿地發(fā)展高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)甘草產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

本試驗于2019 年3?8 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科樓中草藥實(shí)驗室進(jìn)行，甘草種子產(chǎn)自甘肅酒泉，以甘草無菌苗的葉片和根系為供試材料。

挑選適量顆粒飽滿、大小均勻的種子，加98%的濃硫酸攪拌加工35 min，無菌蒸餾水清洗5～6 次，76%乙醇浸潤1 min，清洗4 次，用0.1%升汞在超凈工作臺上進(jìn)行8 min 浸泡消毒，然后用無菌蒸餾水反復(fù)清洗至液體變澄清，最后用殺菌消毒的濾紙擦拭甘草種子，以每瓶8 粒種子接種到高壓滅菌的MS 培養(yǎng)基（含大量元素N、P、K 和Ca 以及微量元素 I、B、Mn、Mo、Cu、Co 和 Fe），置培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上。在光照時長為 12～14 h·d?1、溫度為（24±2）℃、濕度為30%～50%的培養(yǎng)室中，使甘草種子發(fā)芽生長，待其生長至10、20 和30 d 時，分別測定幼苗葉綠素、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性及甘草總黃酮含量，測定生長至20 d 的幼苗生長量。試驗共7 個處理：1）CK1（MS 營養(yǎng)液）；2）CK2（0 mmol·L?1海藻糖+50mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；3）T1（5 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；4）T2（10 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；5）T3（15 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；6）T4（20 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；7）T5（25 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）。每個處理重復(fù) 3 次。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 甘草幼苗生長量的測定 用無菌濾紙擦拭供試幼苗表面附著的培養(yǎng)基，分離幼苗的地上和地下部分，分別測量其長度、稱其鮮重。

1.2.2 葉綠體色素含量的測定［20］采用丙酮法進(jìn)行葉綠體色素提取，用分光光度法進(jìn)行葉綠體色素含量的測定。

1.2.3 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定［20］采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行測定。

1.2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定 用水浴法進(jìn)行可溶性糖的提取，用蒽酮法測定其含量［20］；用磺基水楊酸法進(jìn)行脯氨酸提取，用水合茚三酮法測定其含量［21］。采用火焰光度法進(jìn)行Na+和K+濃度的測定［22］。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定 用冰浴研磨、冷凍離心法進(jìn)行抗氧化酶液的提取。采用NBT 光化還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［23］；愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［23］；用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性［24］。

1.2.6 總黃酮含量的測定 采用超聲法［25］進(jìn)行提取，用紫外分光光度法對甘草幼苗的總黃酮含量進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，用LSD 法進(jìn)行方差分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗生物量的影響

表1 是甘草幼苗生長至20 d 所測的生物量，由此可知，CK2處理長勢最弱，T3處理相對于其他6 個處理長勢較好。NaHCO3脅迫顯著抑制了甘草幼苗的生長，加入外源海藻糖后甘草幼苗生長受抑制作用減弱。與CK1處理相比，CK2處理根長、株高、根系鮮重和全重分別減少了18.88%、23.06%、31.25%和15.70%。梯度濃度外源海藻糖的施加，對甘草幼苗的生物量產(chǎn)生了正面影響，同一時期T1、T2、T3、T4、T5處理與CK2處理相比，根長分別增長了 24.52%、26.44%、29.73%、25.07% 和 20.00%，株高分別增長 27.25%、37.74%、55.14%、29.35% 和22.22%，根系鮮重分別增加了13.63%、29.54%、52.27%、38.63% 和6.81%，全株鮮重分別增加了6.21%、11.72%、19.31%、5.51%和1.38%，綜上所知，T3處理最佳。

表1 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗生物量的影響Table 1 Effects of trehalose at different concentrations on the biomass of licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.2 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗葉片中葉綠體色素含量的影響

圖1 表明，隨著生長天數(shù)的改變甘草幼苗葉片的葉綠素不斷積累，NaHCO3脅迫（CK2）處理下甘草幼苗葉片的葉綠素含量均較CK1處理低，生長10、20 和30 d 后，分別較CK1處理減少了52.22%、49.95%、50.93%，與CK1處理均達(dá)到顯著性差異，說明在NaHCO3脅迫下葉綠素部分被降解；施加不同濃度海藻糖的各處理中葉綠素含量均高于CK2處理，且與其差異顯著，其中15 mmol·L?1的海藻糖濃度處理最佳，不同時期，分別較CK2處理增加101.21%、93.52%和92.33%，表明適宜濃度的外源海藻糖能提高NaHCO3脅迫下甘草幼苗葉片葉綠素含量。

圖1 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗葉綠素含量的影響Fig. 1 Effects of trehalose concentration on chlorophyll content in licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.3 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗丙二醛（MDA）含量的影響

MDA 的積累對植物細(xì)胞膜和細(xì)胞會造成一定的傷害 ，由圖 2 可知 ，甘草 幼苗生長 10、20 和 30 d 后，NaHCO3脅迫下，甘草幼苗的MDA 含量顯著高于CK1，分別升高34.38%、28.95%和29.27%，施加不同濃度海藻糖后，MDA 含量變化呈先下降再上升的趨勢，T3處理的MDA 含量達(dá)到最低值，較CK2處理分別減少了23.26%、18.37%和14.15%。表明NaHCO3脅迫使得甘草幼苗細(xì)胞膜受到損傷，施加外源海藻糖能減輕NaHCO3脅迫對甘草幼苗造成的傷害。

圖2 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗MDA 含量的影響Fig. 2 Effects of trehalose at different concentrations on MDA content of licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.4 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖3 顯示外源海藻糖對NaHCO3脅迫下甘草幼苗中可溶性糖含量的變化，結(jié)果表明，在NaHCO3脅迫下，不同生長天數(shù)甘草幼苗內(nèi)的可溶性糖含量相比空白對照顯著增加，生長 10、20、30 d 后，分別增加了44.79%、32.80%和25.31%，當(dāng)外源海藻糖濃度增加到 15 mmol·L?1時，即 T3處理，甘草幼苗生長 10、20、30 d 后可溶性糖含量與CK1處理相近，分別較CK2減少34.53%、20.48% 和19.21%，說明外源海藻糖對NaHCO3脅迫條件下的甘草幼苗具有緩解效應(yīng)。

圖3 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of trehalose at different concentrations on soluble sugar content in licorice seedlings under NaHCO3 stress

由圖4 可知，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中Pro 含量較 CK1處 理 增 加 ，生 長 10、20、30 d 后 ，分 別 增 加100.28%、82.01%和106.51%，NaHCO3脅迫下施加不同濃度海藻糖后，甘草幼苗中Pro 含量下降，T3處理達(dá)到最低水平，隨著天數(shù)增加，T3處理分別較CK2處理降低61.24%、42.73%和51.01%，且生長到10、20和30 d 時均達(dá)到顯著水平。

圖4 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中Pro 含量的影響Fig. 4 Effects of trehalose at different concentrations on Pro content of licorice seedlings under NaHCO3 stress

由圖5 可知，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中Na+濃度顯著增加，K+濃度和K+/Na+顯著降低，不同生長天數(shù)CK2處理的 Na+濃度為 CK1處理的 1.5～2.0 倍，K+濃度和 K+/Na+較 CK1處理分別降低 40%～50% 和71%～73%，表明外源海藻糖可顯著降低NaHCO3脅迫下Na+濃度，提高K+濃度，進(jìn)而提高甘草幼苗中K+/Na+。

圖5 NaHCO3 脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中Na+濃度、K+濃度和 K+/Na+的影響Fig. 5 Effects of trehalose at different concentrations on Na+concentration，K+ concentration and K+/Na+ in licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.5 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對抗氧化酶活性的影響

由圖6 可知，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中SOD、POD 和CAT 活性均低于對照，與對照相比，甘草幼苗生長10、20 和 30 d 后，SOD 活性與對照處理相比分別降低了21.91%、31.33%和21.77%，POD 活性分別降低了21.91%、35.89%和29.63%，CAT 活性分別降低了7.49%、8.56%和6.01%。用不同濃度海藻糖處理后 SOD、POD、CAT 活性均顯著升高，T3處理達(dá)到最佳水平。隨著生長天數(shù)增加，T3處理與CK2處理相比 ，SOD 活 性 分 別 升 高 112.28%、117.16% 和33.67%，POD 活性分別升高 105.88%、113.76% 和56.98%，CAT 活性 分別升高 50.03%、47.97% 和41.13% 。表明外源海藻糖可通過提高抗氧化保護(hù)酶活性而緩解NaHCO3脅迫對甘草生長造成的傷害。

圖6 NaHCO3 脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中SOD、POD、CAT 活性的影響Fig.6 Effects of trehalose at different concentrations on SOD，POD，CAT activity in licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.6 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中總黃酮含量的影響

由圖7 可知，隨著生長天數(shù)增加，甘草幼苗中總黃酮含量不斷積累，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中總黃酮含量顯著降低，甘草幼苗生長10、20 和30 d 時，CK2較CK1處理分別減少了72.94%、64.58%和62.66%。施加不同濃度外源海藻糖后，甘草幼苗中總黃酮含量先快速上升后緩慢降低，T3處理比CK1處理稍低，較其他處理顯著升高，隨著生長天數(shù)增加，較CK2處理分別升高2.43、1.48 和 1.56 倍 。

圖7 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中總黃酮含量的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of trehalose on total flavonoid content in licorice seedlings under NaHCO3 stress

3 討論

生物量是植物對鹽堿脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，也是評估植物對堿脅迫抗性的直接指標(biāo)［26］。鹽堿組分是抑制植物生長最常見、最主要的非生物因子［27］。已有大量研究表明，堿脅迫可顯著降低燕麥（Avena sativa）幼苗和紅花（Carthamus tinctorius）幼苗的生物量［28?29］。本研究中，由于在 50 mmol·L?1NaHCO3脅迫下Na+含量過高，致使甘草幼苗嚴(yán)重失水，與甘草幼苗生長所需的其他礦質(zhì)元素產(chǎn)生拮抗作用，影響幼苗對必須礦質(zhì)元素的吸收，抑制了甘草幼苗的生長，甘草幼苗的生物量（根長、株高、地上部分的鮮重和幼苗全重）均顯著降低。施加外源海藻糖降低了甘草幼苗中Na+的積累，甘草幼苗的生長量有不同幅度的提高，其中15 mmol·L?1的海藻糖增幅最大，為最佳處理濃度，表明施加適宜濃度海藻糖能夠緩解NaHCO3脅迫對甘草幼苗生長的抑制作用。

葉綠體色素是綠色植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量的高低決定了光合作用的強(qiáng)弱［30］。在本研究中NaHCO3脅迫下葉綠體膜受損，妨礙葉綠體色素的合成，甘草幼苗葉片中葉綠素含量顯著降低，施加梯度濃度外源海藻糖后葉綠素含量呈倒V 形變化，可能與海藻糖能夠一定程度清除植物體內(nèi)活性氧有關(guān)，從而保護(hù)甘草幼苗葉綠體膜的穩(wěn)定性。

鹽堿脅迫會引起植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 積累，其含量高低可以作為植物膜脂受損傷程度的衡量指標(biāo)［31］。有研究表明，鹽堿脅迫下，施加適宜濃度海藻糖可降低玉米（Zea mays）幼苗［27］和月見草（Oenothera biennis）［32］的 MDA 含量，本研究結(jié)果與之一致，NaHCO3脅迫導(dǎo)致甘草幼苗中自由基積累，引發(fā)膜脂過氧化作用，甘草幼苗中MDA 含量顯著增加，施加15 mmol·L?1外源海藻糖后，MAD含量降到最低，減輕了MDA 對細(xì)胞膜的傷害，可能與海藻糖具有很強(qiáng)的抗脫水能力，可以在NaHCO3脅迫下保護(hù)生物膜免受傷害有關(guān)［33］。

NaHCO3脅迫下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如Pro、Na+、K+和可溶性糖等，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢，不會造成細(xì)胞嚴(yán)重失水，使生物大分子的功能和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定［34］。劉建新等［35］研究發(fā)現(xiàn)，施加外源過氧化氫后降低了堿脅迫下燕麥幼苗中Pro 含量和可溶性糖含量。本試驗結(jié)果與之相似，50 mmol·L?1NaHCO3脅迫下甘草幼苗細(xì)胞吸水困難，造成甘草幼苗生理干旱，促進(jìn)甘草幼苗中Pro 和可溶性糖的積累，其含量的增加可以提高甘草幼苗對NaHCO3脅迫的抵抗能力，施加15 mmol·L?1外源海藻糖甘草幼苗中Pro 和可溶性糖含量顯著降低。Na+和K+的代謝具有重要意義，是生物體緩解堿脅迫帶來嚴(yán)重危害的生理基礎(chǔ)［36］。本研究與趙瑩等［37］的研究結(jié)果一致，NaHCO3脅迫下施加外源海藻糖可以降低Na+濃度，升高K+濃度和K+/Na+，達(dá)到維持K+/Na+動態(tài)平衡的目的，從而可以增加細(xì)胞質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，減輕NaHCO3脅迫對甘草幼苗的傷害。海藻糖濃度超過15 mmol·L?1后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對NaHCO3脅迫的緩解作用有所減弱，可能是由于海藻糖濃度過高，鑲嵌在甘草幼苗細(xì)胞磷脂雙分子層上的各種酶結(jié)構(gòu)有所破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損。

抗氧化保護(hù)酶活性的高低與植物耐鹽堿的程度有關(guān)，可以在一定程度上指示植物遭受脅迫的程度［38］?？寡趸Ｗo(hù)酶體系主要組成成分有SOD、POD 和CAT 等，它們使植物體內(nèi)的活性氧代謝處于動態(tài)平衡，從而抵御活性氧自由基對細(xì)胞的毒害［39］。研究發(fā)現(xiàn)，堿脅迫下黑麥草（Loliumspp.）［40］中 SOD、CAT 和 POD 活性顯著降低，本研究結(jié)果與其一致，15 mmol·L?1海藻糖處理后，SOD、POD 和 CAT 活性顯著增強(qiáng)，POD 可以清除甘草幼苗在NaHCO3脅迫下產(chǎn)生的過多的活性氧，CAT 和POD 可以清除在清除活性氧后所產(chǎn)生的其他自由基，維持了甘草幼苗細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，減輕活性氧對植物造成的傷害，提高甘草幼苗的耐堿性。以此推測，海藻糖提高堿脅迫下甘草幼苗中抗氧化保護(hù)酶活性可能與誘導(dǎo)SOD 基因表達(dá)有關(guān)。

甘草總黃酮目前在美容化妝品中應(yīng)用極為廣泛，因為甘草總黃酮可以抑制絡(luò)氨酸酶活性、清除氧自由基、抗炎、抗變態(tài)，因此可以起到美白褪斑作用。本研究表明NaHCO3脅迫對甘草幼苗中總黃酮含量的積累有很強(qiáng)的抑制作用，15 mmol·L?1海藻糖對這種抑制作用的緩解效果極顯著。

4 結(jié)論

50 mmol·L?1NaHCO3脅迫對甘草幼苗的生長具有明顯的抑制作用，一定濃度的外源海藻糖可以緩解甘草幼苗生長受到的抑制，15 mmol·L?1海藻糖緩解效果最佳。15 mmol·L?1外源海藻糖能夠顯著提高NaHCO3脅迫下甘草幼苗的生長量，增加甘草幼苗葉片中的葉綠素含量，提高光合產(chǎn)量，有效調(diào)節(jié)甘草幼苗細(xì)胞的滲透勢，高效提高抗氧化保護(hù)酶活性，維持甘草幼苗生長系統(tǒng)的完整性，還能顯著提高甘草黃酮的含量，進(jìn)而提升甘草的商用價值。