促進鎘吸收積累的植物根際促生菌的篩選及其對一年生黑麥草的影響

吳慧麗，田薇，紀燕玲，婁來清，蔡慶生

（南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，江蘇南京210095）

當今世界經(jīng)濟快速發(fā)展，工業(yè)化進程加快，土壤重金屬主要通過廢水處理、農(nóng)藥噴灑、采礦等污染各種生態(tài)系統(tǒng)，通過食物鏈進入人體，進而危害健康。根據(jù)全國土壤污染狀況調(diào)查公報［1］，鎘的點位超標率達7.0%，位于無機污染物之首。鎘（cadmium，Cd）是“五毒”元素（鎘、鉛、汞、銅、砷）之一，是一種非必需元素，具有遷移速度快、毒性強、難以降解等特點。它能夠抑制植物生長，影響?zhàn)B分吸收和內(nèi)環(huán)境平衡。鎘進入人體可能會對肺、腎臟、睪丸、胎盤和骨骼等各種器官造成生理損害［2］。最先起源于日本富山縣的鎘中毒事件，其主要的癥狀表現(xiàn)為骨軟化、骨折及骨質(zhì)疏松［3］。

重金屬污染土壤亟待修復。在眾多修復方式中，植物?微生物聯(lián)合修復因其低成本和高效率而備受關(guān)注。它是將植物和微生物結(jié)合起來，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，直接或間接地吸收、轉(zhuǎn)化土壤中的重金屬元素。微生物可以活化或鈍化土壤中的重金屬，增加或減少植物對重金屬的吸收。在根際，根系分泌出營養(yǎng)豐富的分泌物，這些分泌物對促進微生物的生長至關(guān)重要。反之，微生物提供了一個理想的土壤環(huán)境，植物根系可以從土壤中吸收水分和礦物質(zhì)。然而，大多數(shù)超積累植物生長速度緩慢［4］、生物量較小、修復范圍和效率有限［5］；而許多微生物不僅能夠促進植物生長，其本身和代謝物可通過不同機制對土壤進行修復。因此，將生物量大的植物與微生物結(jié)合起來，兩者相互作用，可以提高重金屬污染土壤的修復效率。

植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指生長在植物根際土壤中，能夠促進植物生長、提高植物抗性的一類有益細菌［6］。PGPR 通過分泌生長素、溶磷、產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脫氨酶和鐵載體直接或間接地促進植物生長［7］。已有報道表明，接種PGPR 能夠增加水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、蘿卜（Raphanus sativus）、甜椒（Capsicum annuumvar.grossum）等的生物量，提高植物重金屬耐性［8?10］。多花黑麥草（Lolium multiflorum）又名一年生黑麥草，根系發(fā)達、生物量大、抗生物脅迫、易于栽培，適應性廣，可用于植物修復和生物乙醇生產(chǎn)，被認為是良好植被恢復物種［11］，在我國長江中下游及其以南地區(qū)有較大面積的栽培和利用［12］。之前的研究表明，黑麥草能夠耐受鎘脅迫［13］，且黑麥草?水稻輪作系統(tǒng)能夠移除稻田中的鎘污染［14］。

本研究從鎘污染地區(qū)的植物根際分離出PGPR 菌株，將其接種到一年生黑麥草上，測定黑麥草生物量及體內(nèi)鎘含量，期望達到修復鎘污染土壤的目的。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

根際土壤取自湖南省郴州市桂陽縣官溪村（25°43′N，112°45′E，海拔202.3 m）的重金屬污染區(qū)，土壤pH 為6.1，鎘濃度為 1.73～2.71 mg·kg?1，平均值為 2.21 mg·kg?1，超過國家標準［15］（水田，5.5＜pH≤6.5，0.4 mg·kg?1）近6 倍。將植物根際土壤取出，用保鮮膜將土壤包裹住，避免水分蒸發(fā)。盡快送到實驗室內(nèi)進行下一步處理。

1.2 耐鎘菌株的分離及鑒定

1.2.1 耐鎘菌的分離 將根表面的土剝離，用滅過菌的刷子取附著在根系表面的根際土樣0.1 g 加入0.1 mL無菌水中，梯度稀釋至 10?5，分別從稀釋度為 10?3、10?4、10?5的稀釋液中取 0.1 mL 涂布固體 LB 平板，根據(jù)菌落不同的形態(tài)選取菌株，用滅過菌的牙簽點接在含 0、0.5、1.0 mmol·L?1鎘（CdCl2·2.5H2O）的平板上，選取能在 1.0 mmol·L?1平板上穩(wěn)定生長的菌株保存在?80 ℃冰箱中，作為后續(xù)菌株。

1.2.2 耐鎘菌株促生特性的研究 吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）的測定參考Gordon 等［16］的方法；溶磷能力的測定參考黃靜等［17］的方法，用溶磷圈直徑（D）與菌株直徑（d）的比值（D/d）表示溶磷能力的大?。划a(chǎn)ACC 脫氨酶能力的測定參考夏娟娟［18］的方法；產(chǎn)鐵載體能力的測定參考Kumar 等［19］的方法。

1.2.3 促生試驗 綜合促生特性指標，選出具有促生潛能的菌株進行水培促生試驗。將一年生黑麥草牧瑤（IdyⅡ）種子用10%過氧化氫表面消毒15 min，去離子水沖洗幾遍，采用漂洗法進行種子萌發(fā)。6 d 后選取生長一致的幼苗移栽到1 L 的塑料桶（12 cm×12 cm×14 cm）中進行營養(yǎng)液（1/4 Hoagland，pH 6.5）培養(yǎng)，長至三葉一心期鎘處理9 d，此時換為1/2 Hoagland 營養(yǎng)液。每次更換營養(yǎng)液時用菌液浸根1.5 h，每個處理設(shè)置3 個重復。收苗測定株高、生物量、微波消解后用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（NexION 2000，PerkinElmer，USA）測定鎘含量。鎘積累量計算公式：Cd 積累量=生物量（根系或地上部干重）×植物組織中Cd 濃度。

菌懸液的制備：菌株接入液體LB 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1000 mL，pH=7.0）中，28 ℃、（180±20）r·min?1培養(yǎng) 12 h。5000 r·min?1離心 10 min，無菌水洗滌兩遍，最后用無菌水重新懸浮，使OD600為 1。

1.2.4 菌株鑒定 利用細菌通用引物進行PCR 擴增，以獲得細菌的16S rRNA。以菌株的總DNA 為模板，進行PCR 擴增。之后將16S rRNA 基因擴增產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司進行測序。將獲得的16S rDNA 序列與NCBI 的Genbank 基因庫中的數(shù)據(jù)進行BLAST 比對，與其中的已知序列進行同源性分析。

1.3 盆栽試驗

1.3.1 試驗設(shè)計 盆栽試驗在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓實驗基地進行，土壤樣品風干過篩后加鎘。配置一定濃度CdCl2·2.5H2O 水溶液，用噴壺將含鎘母液加到土壤中混合均勻，使鎘的最終濃度為（19.5±0.42）mg·kg?1。使用大小一致的塑料盆，每個盆中裝約5 kg 的土壤，每個處理3 個重復，選取耐鎘性不同的一年生黑麥草品種［20?21］（耐鎘型IdyⅡ和鎘敏感型Wasehope）進行盆栽試驗。水培黑麥草至三葉一心期移苗，移前用菌液浸根1.5 h，對照用無菌水浸根。每盆6 棵苗，培養(yǎng)60 d 后收苗。

1.3.2 樣品處理 收苗前測定株高、分蘗數(shù)。將黑麥草沿著土壤表面剪下，將盆栽土壤浸在水中反復沖洗，洗凈根系表面的土壤，將根取出。測定干鮮重及鎘含量，同時取盆栽土樣風干后研磨過孔徑0.15 mm 篩，采用DTPA 法［22］測定土壤有效態(tài)鎘含量。采用95%乙醇提取法測定葉綠素含量。用Li6400 光合儀進行光合參數(shù)的測定，測定時采用開放氣路，將葉室 CO2濃度設(shè)置成 400 μmol·m?2·s?1，每個處理 3 個重復，取各項平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016 整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 25.0 進行方差分析，采用Duncan 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘菌株的篩選及促生特性研究

通過平板試驗，共篩選出30 株在含1.0 mmol·L?1鎘平板上生長的菌株，經(jīng)過促生特性研究及促生試驗篩選，選擇Pi01 和Ma02 作為供試菌株（表1）。2 株菌均能產(chǎn)生IAA、鐵載體，此外，Ma02 還具有溶磷能力（表2）。

表1 30 株耐鎘菌促生特性Table 1 Characteristics of 30 cadmium tolerant strains

表2 供試菌株促生特性Table 2 Promoting characteristics of tested strains

2.2 菌株鑒定

測序結(jié)果與GenBank 中其他菌株的16S rRNA 基因序列進行比對，結(jié)合菌株形態(tài)，鑒定結(jié)果見表3 和表4。菌株 Ma02 和 Pi01 均為腸桿菌屬（Enterobactersp.）。

表3 菌株革蘭氏染色結(jié)果Table 3 Strains of gram stain results

表4 菌株鑒定結(jié)果Table 4 Strain identification results

2.3 不同處理下PGPR 對兩種一年生黑麥草生長參數(shù)的影響

接種Pi01 和Ma02，與空白對照組相比，Idy Ⅱ和Wasehope 分蘗數(shù)分別增加23.6%、23.6% 和11.3%、17.0%，差異顯著（P＜0.05）。鎘處理下，接種Pi01、Ma02，IdyⅡ分蘗數(shù)增加44.2%、48.8%，Wasehope 分蘗數(shù)增加19.5%、46.3%，差異顯著（P＜0.05，圖1A）。

與單一鎘處理相比，只接種Pi01 和Ma02 黑麥草的株高有所提高，IdyⅡ株高增加27.6%且達到顯著水平（P＜0.05）；鎘處理后，接種Ma02，Wasehope 株高增加12.3%，差異顯著（P＜0.05，圖1B）。接菌處理后，IdyⅡ和Wasehope 的干重均有所增加。單獨接菌處理，與空白對照相比，接種Ma02 后IdyⅡ地上部干重顯著增加；鎘處理下，接種Ma02，IdyⅡ和Wasehope 地上部干重增加44.9%、51.3%；接種Pi01，IdyⅡ地上部干重增加39.1%，差異均顯著（P＜0.05，圖1C）。鎘處理下，接種Pi01、Ma02，IdyⅡ和Wasehope 地下部干重分別增加20.8%、25.4%和28.0%、36.9%，差異均顯著（P＜0.05，圖1D）。

圖1 不同處理對兩種一年生黑麥草分蘗數(shù)、株高和干重的影響Fig. 1 Effects of different treatments on the tiller number，plant height，and dry weight of two annual ryegrass species（mean±SD，n=3）

2.4 不同處理下PGPR 對兩種一年生黑麥草鎘含量的影響

接種兩種PGPR 后，地上部及地下部鎘濃度均有所增加。其中，在鎘處理下，接種Pi01 后，IdyⅡ地上部鎘濃度比單一鎘處理對照增加21.8%，差異顯著（P＜0.05，圖2A）；在鎘處理下，接種Pi01 后，IdyⅡ地下部鎘濃度比單一鎘處理對照增加25.5%，接種Ma02 后，IdyⅡ和Wasehope 地下部鎘濃度增加24.3% 和37.2%，差異均顯著（P＜0.05，圖2B）。

圖2 不同處理對兩種一年生黑麥草鎘濃度、轉(zhuǎn)運系數(shù)、鎘積累量和鎘積累總量的影響Fig. 2 Effects of different treatments on cadmium concentration，translocation factor，cadmium accumulation and cadmium accumulation of two annual ryegrass species（mean±SD，n=3）

鎘處理下，接種兩種PGPR 對兩種一年生黑麥草鎘吸收積累方面的影響較為顯著，接種Pi01、Ma02 后，IdyⅡ和Wasehope 的地上部鎘積累量分別增加69.0%、61.7%和49.5%、76.1%，差異均顯著（P＜0.05，圖2D）；接種Pi01、Ma02 后，IdyⅡ和Wasehope 的地下部鎘積累量分別增加51.6%、49.3%和57.2%、85.5%，差異均顯著（P＜0.05，圖2E）。

就鎘積累總量而言，鎘脅迫下接種Pi01、Ma02，IdyⅡ和Wasehope 的鎘積累總量分別增加62.6%、57.2% 和52.0%、79.2%，差異均顯著（P＜0.05，圖2F）。鎘處理同時接種PGPR，鎘的轉(zhuǎn)運系數(shù)略有降低，未形成差異（圖2C）。

2.5 不同處理下PGPR 對兩種一年生黑麥草葉綠素含量的影響

無鎘處理時，接種Ma02，IdyⅡ和Wasehope 的葉綠素含量增加24.4%、17.7%，達到顯著差異水平（P＜0.05）。鎘處理的同時接種 Pi01、Ma02，與單一鎘處理對照相比，IdyⅡ的葉綠素含量增加24.7%、41.9%，形成顯著差異（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同處理對兩種一年生黑麥草葉綠素含量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on the total chlorophyll content of two annual ryegrass species（mean±SD，n=3）

鎘處理后，與空白對照相比，兩種一年生黑麥草的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）均下降，胞間二氧化碳濃度（intercellular CO2concentration，Ci）升高。但鎘處理同時接種Ma02 后，IdyⅡ的凈光合速率較單一鎘處理增加27.8%，差異顯著（P＜0.05，圖4A）。鎘處理同時分別接種Pi01 和Ma02，一年生黑麥草Wasehope 的氣孔導度較單一鎘處理分別增加34.0%，48.2%（圖4B），胞間二氧化碳濃度減少8.9%、8.5%（圖4C），均達顯著差異（P＜0.05）。鎘處理時接種Ma02，IdyⅡ的蒸騰速率（Tr）較單一鎘處理增加37.6%（圖4D），達到顯著差異（P＜0.05）。

圖4 不同處理對兩種一年生黑麥草Pn，Gs，Ci和Tr的影響Fig.4 Effects of different treatments on Pn，Gs，Ci and Tr of two annual ryegrass（mean±SD，n=3）

2.6 PGPR 對根際土壤中鎘的生物有效性含量變化的影響

鎘的生物有效性指可以被植物利用的那部分，其主要取決于土壤對鎘的吸附能力。鎘處理的同時接種Pi01 與單一鎘處理相比，IdyⅡ和Wasehope 根際土壤鎘有效態(tài)增加9.1% 和7.2%，差異性顯著（P＜0.05）；接種Ma02 后，兩種一年生黑麥草根際土壤有效態(tài)均增加但未達到顯著差異（圖5）。

圖5 不同處理對兩種一年生黑麥草根際土壤鎘有效態(tài)的影響Fig. 5 Effects of different treatments on the available cadmium in the rhizosphere soil of two annual ryegrass（mean±SD，n=3）

3 討論

植物?微生物聯(lián)合修復重金屬污染土壤具有原位、環(huán)保、費用低等優(yōu)點，在修復方面前景廣闊。PGPR 通過分泌IAA、溶磷、產(chǎn)生鐵載體、產(chǎn)生ACC 脫氨酶降低乙烯水平促進植物生長，增加其生物量［23?24］。本研究中使用的 PGPR 具有上述部分特征（表 2）。Akmak［25］將有多種促生特性的 PGPR 接種到茶樹（Camellia sinensis）上，發(fā)現(xiàn)其增加了茶樹的株高、分蘗數(shù)，本研究中的結(jié)果與之相似（圖1A，B）。Kamran 等［26］在鎘脅迫下接種假單胞菌可促進芥菜（Brassica juncea）的生長；Khanna 等［27］將銅綠假單胞菌和劍蘭伯克霍爾德氏菌接種到番茄（Solanum lycopersicum）上，提高了番茄的生物量；Ferchichi 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在田間條件下，菌株LJ121和LJ215 能夠增加羽扇豆（Lupinus micranthus）的籽粒產(chǎn)量。此外，PGPR 可以分泌有機酸物質(zhì)，降低土壤pH，使土壤中的不溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收的形態(tài)，來促進植物生長。本試驗中，鎘脅迫后接種PGPR，兩種一年生黑麥草地上部及地下部的干重顯著增加，敏感型品種Wasehope 地下部干重增幅更大，促生效果表現(xiàn)較為突出（圖1D）。這可能歸因于PGPR 產(chǎn)生IAA 的能力，作為一種信號分子，IAA 在植物及其內(nèi)生微生物的相互作用中起著關(guān)鍵作用。但是，PGPR 和IAA 對植物生長和重金屬吸收的影響尚不清楚。

鎘脅迫可影響光合作用、根系呼吸等生理過程。葉綠素含量被認為是光合作用的指標。鎘處理大幅降低了葉綠素含量（圖3），說明鎘對光合作用有不利影響。接種PGPR 可增加葉綠素含量，改善了光合作用，緩解鎘脅迫下黑麥草Pn、Gs、Tr的下降和Ci的增加（圖4），這可能是黑麥草生物量增加的原因。本試驗中接種PGPR 后兩種黑麥草的葉綠素含量均有所增加，試驗結(jié)果與Wali 等［29］的一致。植物各器官中，根系在金屬吸收和轉(zhuǎn)運中起著不可代替的作用，它最先感知到鎘脅迫，隨著鎘濃度增加，紫花苜蓿（Medicago sativa）根系總表面積、總體積、平均直徑等顯著下降［30］。根系形態(tài)改善使得根系體積增加，增大了與鎘的接觸面積，加大了鎘的積累。

接種 PGPR 可增加植物中鎘的積累量。Wang 等［31］在研究中發(fā)現(xiàn)，用 2 μmol·L?1鎘處理，與對照組相比，接種植物促生菌芥菜地上部的鎘積累達261%，在根系的積累達8.93 倍。Itusha 等［32］的盆栽研究表明，與對照相比，接種PGPR 香根草（Vetiveria zizanioides）的根長和株高分別增加了21.4%和17.36%，鎘的吸收增加了67.7%。Asad 等［33］將 HRS-C3 接種到甘藍（Brassica oleracea），發(fā)現(xiàn)其干重從 214.50 mg 增加至 295.30 mg，且增加了對鎘的吸收。接種PGPR 能夠活化土壤中的有效態(tài)鎘，使其含量增加（圖5），與Han 等［34］的結(jié)果相同。本試驗中，接種PGPR 后能增加耐鎘性不同的兩種一年生黑麥草的鎘含量，這一現(xiàn)象可以解釋為，一方面接種PGPR 增加了黑麥草的生物量，另一方面PGPR 接種活化土壤中的鎘促進了黑麥草對鎘的吸收，進一步導致了鎘的高積累，并且在敏感型品種Wasehope 中單株鎘積累量更高（圖2F），這說明在（19.5±0.42）mg·kg?1的鎘污染土地上適宜種植Wasehope，可開發(fā)其作為能源植物的潛力。此外，與Wasehope 相比，IdyII 地上部及地下部相對較低的鎘濃度表明IdyII 可能是一個鎘排斥型品種（圖2A，B），這種作用機制還需要進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，從鎘污染地區(qū)植物根際土壤中篩選出的2 株P(guān)GPR 都能促進一年生黑麥草的生長。鎘脅迫下接種PGPR 能夠增加一年生黑麥草的株高、分蘗數(shù)、生物量，提高葉綠素、改善光合作用。就鎘含量而言，在本試驗條件下種植Wasehope 更利于土壤修復，但是PGPR 促生的穩(wěn)定性還需開展長期田間試驗。