動物源性中藥材獸藥殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展

許曉輝，李劍勇，朱仁愿，潘秀麗，李晨曦，王小喬*

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心，蘭州 730050；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

獸藥廣泛用于動物養(yǎng)殖過程中，規(guī)范使用獸藥可有效減少動物病患，但若違規(guī)超劑量超范圍使用獸藥，將給食品藥品安全帶來極大風(fēng)險。目前，政府及社會各界對動物源性食品中獸藥殘留的安全問題給予高度重視[1]，通過制定一系列國家標(biāo)準(zhǔn)，并每年都進(jìn)行監(jiān)督抽檢，監(jiān)控其質(zhì)量安全[2]。但對動物源性中藥材尚缺乏有效管控，因此，對動物源性中藥材獸藥殘留的問題予以關(guān)注，并對其進(jìn)行有效控制，迫在眉睫。

1 動物源性中藥材獸藥殘留檢測現(xiàn)狀

動物源性中藥材是指來源于動物整體、器官、生理或病理產(chǎn)物等供藥用的中藥材，是中藥材的重要組成部分。我國動物源性中藥材應(yīng)用歷史悠久，中醫(yī)臨床常用的300余種中藥材中，動物源性約占10%[3]。目前，大多數(shù)動物源性中藥材以人工飼養(yǎng)為主，多以農(nóng)戶為單位，缺乏基本養(yǎng)殖常識及科學(xué)技術(shù)手段，在養(yǎng)殖過程中，為防治疾病、促進(jìn)生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率，廣泛使用了高效、低成本的抗菌劑、抗生素和激素等獸藥，甚至使用一些退市的獸藥。獸藥的不合理使用甚至濫用，致使其難以降解及排泄，在逐漸積累的情況下蓄積在中藥材中，導(dǎo)致療效降低，危害人體健康，更有甚者對人體器官造成不可逆的損害。

當(dāng)前，動物源性產(chǎn)品獸藥殘留引發(fā)過敏反應(yīng)和抗生素耐藥性問題已成為全球關(guān)注的焦點。為保護(hù)公共健康，US FDA于2015年6月通過獸藥飼料指令頒布了管控微生物藥物使用的最終規(guī)定[4]；歐盟法規(guī)2014/0247(COD)旨在解決抗生素耐藥性帶來的公共健康風(fēng)險問題[5]；在我國，為管控動物源性食品中獸藥殘留，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布了《GB 31650-2019 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源性食品獸藥殘留的最大限值[6]，但是不涉及動物源性中藥材，且動物源性中藥材獸藥殘留檢測相關(guān)研究報道少見?，F(xiàn)有動物源性基質(zhì)中獸藥殘留檢測方法基本以一個類別或一小組相似類別的獸藥為主[7-9]，為有效監(jiān)測獸藥殘留及保護(hù)公共健康，迫切需要開發(fā)能夠同時進(jìn)行多類別多組分獸藥殘留檢測的技術(shù)[10]。

近年來，動物源性中藥材獸藥殘留問題逐漸被研究學(xué)者所關(guān)注，一些研究成果相繼被報道，如孫健等人應(yīng)用QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的離子豐度比定性篩查中藥材熊膽粉中多種獸藥殘留，包括β-受體激動劑與拮抗劑、青霉素類、頭孢菌素類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、四環(huán)素類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、聚醚類、抗病毒藥、驅(qū)蟲藥、甾體激素、非甾體抗炎藥和鎮(zhèn)靜劑[11]，黃勝廣等人應(yīng)用QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS法測定了梅花鹿鹿茸中的孕激素和鎮(zhèn)靜劑[12-13]。另外，國家監(jiān)管部門對動物源性食品的市場監(jiān)督抽檢結(jié)果顯示，獸藥殘留仍是影響其質(zhì)量安全的重要因素，對于與動物源性食品來源相似的動物源性中藥材必然也存在相同問題，因此，開發(fā)建立動物源性中藥材獸藥殘留高通量檢測技術(shù)，是實現(xiàn)動物源性中藥材獸藥殘留全面監(jiān)控的必然選擇。

2 動物源性中藥材獸藥殘留檢測

動物源性中藥材基質(zhì)復(fù)雜，多含有蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等多種成分，另外，吸收到中藥材中的獸藥殘留含量甚微，且不同獸藥的極性差別大，這些都是獸藥殘留檢測的難點。因此，提高對動物源性中藥材中獸藥殘留問題的認(rèn)識，加強這方面檢測方法的研究，制定國家標(biāo)準(zhǔn)或補充檢驗方法勢在必行，其關(guān)鍵點是前處理方法和儀器檢測方法的研究開發(fā)及應(yīng)用。

2.1 高通量前處理方法 樣品前處理是分析過程中耗時最長、產(chǎn)生誤差最多的一個環(huán)節(jié)，更是多獸藥殘留高通量檢測要突破的瓶頸之一，而動物源性中藥材的基質(zhì)特點是富含蛋白質(zhì)與脂肪，目前，已報道的多獸藥殘留同時檢測高效便捷的前處理方法主要包括分散固相萃取法、QuEChERS法、固相萃取、基質(zhì)固相分散技術(shù)、免疫親和色譜、加速溶劑提取、在線自動凈化等[14-15]，其中應(yīng)用比較廣泛的是分散固相萃取法和QuEChERS法[16-18]。QuEChERS法主要是提取階段除雜，去除蛋白質(zhì)；分散固相萃取法主要是凈化階段除雜，去除脂類，兩者結(jié)合能便捷快速有效降低動物源中藥材中高蛋白高脂肪的基質(zhì)干擾[19]。前處理方法優(yōu)化選擇能代表各類別結(jié)構(gòu)的化合物，以方法考察指標(biāo)考察優(yōu)化提取凈化步驟。包括①提取水相：考察NaOH溶液、Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液和1%醋酸溶液提取效率等；② 提取有機相: 考察乙腈、5%醋酸乙腈溶液和15%醋酸乙腈溶液的提取效率等；③凈化材料: 因動物源性中藥材的基質(zhì)富含脂肪和蛋白質(zhì)，且成分復(fù)雜, 考察C18(十八烷基鍵合硅膠)、PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)、PAX (強陰離子交換)、GCB (石墨化炭) 等多種吸附材料及其比例，最終確定適宜比例的吸附材料作為凈化材料，實現(xiàn)最大程度的吸附雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。如已報道的基于優(yōu)化的QuEChERS前處理技術(shù)，利用液質(zhì)聯(lián)用法測定鹿茸中多獸藥殘留，樣品以乙腈-乙酸乙酯(8∶2)為提取劑，以150 mg PSA、100 mg C18與70 mg的中性氧化鋁為凈化劑，經(jīng)方法學(xué)考察，該方法符合檢測要求。該前處理方法步驟少，簡單易操作，使用時間少，快速便捷，能夠滿足鹿茸中獸藥殘留高通量篩查的要求[20]。

2.2 靶向性檢測 獸藥殘留靶向性檢測主要基于液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)來實現(xiàn)的[21-22]，其高通量篩選采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式(d-MRM)或多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，LC-MS/MS是獸藥殘留檢測的重要工具[23]，但LC-MS/MS作為低分辨質(zhì)譜對采集的點數(shù)有限制，當(dāng)檢測采集方法中化合物數(shù)量比較多時，受駐留時間限和循環(huán)時間限的影響，每個化合物采集點數(shù)會減少，導(dǎo)致檢測靈敏度會下降[24]。高通量靶向性檢測方法的建立是先建立好儀器檢測方法，然后以不同品種動物源性中藥材樣品為基質(zhì)對建立的檢測方法進(jìn)行方法學(xué)考察實驗，當(dāng)做完某一品種動物源性中藥材或做完涵蓋很多品種動物源性中藥材，通過對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比對，篩選出在采集方法條件下對大部分基質(zhì)都適應(yīng)的化合物建立檢測方法，其檢測上百種中藥材獸藥殘留方法建立的篩選流程見圖1。目前，獸藥殘留靶向性檢測不再局限于一個類別或一小組相似類型的獸藥，而是一次前處理，一針進(jìn)樣同時檢測多類別多組分獸藥殘留，如黃勝廣等[20]采用QuEChERS結(jié)合分散固相萃取方法建立了LC-MS/MS同時測定梅花鹿鹿茸中磺胺類、激素類、頭孢類、鎮(zhèn)靜劑類等36種獸藥殘留；采用PSA與HLB組合凈化的方法建立了LC-MS/MS同時測定梅花鹿鹿茸中四環(huán)素類、喹諾酮類等15種獸藥殘留，經(jīng)方法學(xué)驗證，檢出限、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度等指標(biāo)均能滿足要求，該研究實現(xiàn)了一針進(jìn)樣同時檢測鹿茸中多類別多組分獸藥殘留，對動物源性中藥材獸藥殘留的靶向性檢測研究具有參考價值。Yue jin等[25]優(yōu)化了一種快速、簡便、廉價、有效、耐用的QuEChERS前處理方法，該前處理方法同時適用于蜂蜜和蜂王漿兩種復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理，一次樣品制備，應(yīng)用LC-MS/MS可同時定量檢測蜂蜜和蜂王漿中磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素、喹諾酮類、硝基咪唑類等42種獸藥殘留，該方法適用于蜜蜂和蜂王漿樣品中獸藥殘留的快速檢測。

圖1 LC-MS/MS檢測動物源性中藥材多獸藥殘留的方法建立流程Fig 1 Flow procedure of method establishment for the detection of multi-veterinary drug residues in Chinese medicinal materinals of animal origin by LC-MS/MS

2.3 非靶向性檢測 非靶向性檢測是不設(shè)定目標(biāo)去檢測動物源性中藥材中獸藥殘留，其是基于液相-四極桿-飛行時間質(zhì)譜或液相-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜實現(xiàn)的[26-27]，對于飛行時間質(zhì)譜或靜電場軌道阱質(zhì)譜，高通量篩查都是采用全掃描模式，檢測時無需考慮待測目標(biāo)化合物的數(shù)量，全掃描高分辨質(zhì)譜直接采集高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)，獲得的碎片離子用于最終的定性分析和結(jié)構(gòu)確認(rèn)，從而使化合物的確證更加準(zhǔn)確可靠，具有同時篩查大量目標(biāo)化合物的能力，樣品也無需重復(fù)測定[28-29]。同時，在高分辨率下采集的數(shù)據(jù)降低了近似質(zhì)量數(shù)的干擾，更好地避免了假陽性和假陰性的發(fā)生，因此，高分辨質(zhì)譜被廣泛應(yīng)用于多獸藥殘留的篩查與檢測中。對于高分辨質(zhì)譜，通過多級掃描，建立二級譜圖數(shù)據(jù)庫，特別適合高通量的檢測篩查，其個人自建篩查數(shù)據(jù)庫(PCDL)構(gòu)建流程見圖2?；诟叻直嫒珤呙栀|(zhì)譜的高通量技術(shù)定性分析，主要通過已建立數(shù)據(jù)庫比對待測化合物與數(shù)據(jù)庫收載的該化合物在同等條件下的保留時間、同位素分布、二級碎片和二級質(zhì)譜圖相似度，根據(jù)得分綜合判斷去確定[30-32]。目前，基于飛行時間質(zhì)譜或靜電場軌道阱質(zhì)譜非靶向檢測的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫已廣泛建立，如美國國家科學(xué)技術(shù)研究院質(zhì)譜庫(NIST)，Wiley譜庫、中國科學(xué)院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫等。而對于獸藥，已有相關(guān)研究建立了部分獸藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，如郭杰等[33]基于LC-QTOF/MS的定性優(yōu)勢，進(jìn)行了187種藥物的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜分析，并運用PCDL軟件，依次將187種藥物標(biāo)準(zhǔn)物的名稱、保留時間、分子式、結(jié)構(gòu)式、一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖等內(nèi)容導(dǎo)入到PCDL數(shù)據(jù)庫中，建立了非靶向性篩查數(shù)據(jù)庫，依據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫快速篩查人體尿液、血液樣品中是否含有187種藥物，這187藥物大多數(shù)也可以作為獸藥用于動物，因此，該研究建立的數(shù)據(jù)庫也同樣適用于動物源性中藥材獸藥殘留的非靶向篩查。

圖2 LC-QTOF/MS獸藥殘留篩查數(shù)據(jù)庫構(gòu)建流程圖Fig 2 Flow chart of building database to screen veterinary drug residues by LC-QTOF/MS

3 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)的存在導(dǎo)致目標(biāo)待測物響應(yīng)產(chǎn)生變化的現(xiàn)象，降低基質(zhì)效應(yīng)一般從兩個方面考慮，第一是前處理技術(shù)，利用前處理技術(shù)將干擾組分去除；第二是利用色譜分離使目標(biāo)分析物與干擾組分進(jìn)入質(zhì)譜的時間不同[34]。但是，現(xiàn)在液質(zhì)聯(lián)用都采用超高效液相色譜，分析時間短，干擾組分進(jìn)入色譜柱，并不能利用流動相將干擾組分沖出，這樣會影響色譜柱使用壽命，也影響檢測數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，因此，降低基質(zhì)效應(yīng)首先考慮用前處理方法將干擾組分去除干凈?；|(zhì)效應(yīng)的評價是采用空白樣品加標(biāo)后按前處理方法處理，繼而上機測試，比較與同濃度的純?nèi)軇┑捻憫?yīng)值[35-37]，具體方法流程見圖3。

圖3 基質(zhì)效應(yīng)評價方法流程Fig 3 Flow procedure of evaluation method about matrix effect

4 展 望

綜上所述，動物源性中藥材基質(zhì)復(fù)雜，以脂肪和蛋白質(zhì)為主，有些中藥材還要經(jīng)過炮制后方能藥用，這給動物源性中藥材中獸藥殘留高通量檢測方法的建立帶來不確定因素，因此，開發(fā)高通量前處理方法，既要考慮藥材屬性，也要兼顧藥材炮制過程，而高效、自動化的液質(zhì)聯(lián)用儀已經(jīng)為獸藥殘留高通量檢測提供了技術(shù)平臺，通過對不同品種動物源性中藥材進(jìn)行研究，開發(fā)建立專屬性強、靈敏度高的高通量液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)。隨著動物源性中藥材中獸藥殘留問題被研究學(xué)者、監(jiān)管部門等的關(guān)注，發(fā)展快速、簡易、高靈敏度、高通量的多獸藥殘留檢測技術(shù)是當(dāng)前領(lǐng)域的主要研究方向，其可提高分析效率、縮短檢測周期、降低成本、減少環(huán)境污染。目前，發(fā)達(dá)國家研究建立了多類別多組分獸藥殘留檢測和確證方法，而我國研究多獸藥殘留檢測的分析方法雖取得了較大發(fā)展，但整體上還存在較大差距，特別是真正用于實際的多獸藥殘留篩查方法相對匱乏，篩查與確證配套研究不足，影響了獸藥組分檢測的覆蓋面和實際效果，因此，為保障動物源性中藥材獸藥殘留質(zhì)量安全，需進(jìn)一步加強動物源性中藥材中多獸藥殘留的研究，實現(xiàn)動物源性中藥材獸藥殘留的全面、高效監(jiān)控。