第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制研究

王 平，王華勇，王 浩

棗陽市第一人民醫(yī)院康復(fù)科，湖北棗陽 441200

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作為一種自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)晨僵、腫脹、疼痛等，如果得不到及時(shí)治療，則會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，使關(guān)節(jié)喪失正常功能[1-2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鳎兄^高的發(fā)病率和致殘率，是一種全身性的疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。該病的發(fā)病較為隱匿，通常是從手指的近端關(guān)節(jié)、手掌關(guān)節(jié)最先起病，逐漸變?yōu)閷?duì)稱性的關(guān)節(jié)受累。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因仍未完全明確，目前該病仍未找到治療的理想藥物[5]。卡非佐米作為第二代蛋白酶抑制劑，相較于第一代蛋白酶抑制劑，具有抗多發(fā)性骨髓瘤的高效性及低毒性，且能夠一定程度地破壞類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的核因子-κB(NF-κB)活化，抑制破骨細(xì)胞的分化和形成，但第二代蛋白酶抑制劑能否用于臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎目前尚不清楚。所以，本研究使用第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行治療，旨在探討第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取健康SD雄性大鼠(上海杰思捷公司) 30只，體質(zhì)量165～190 g，平均(177.5±11.87)g，按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、抑制劑組，各10只，于23 ℃、45%～55%濕度環(huán)境下喂養(yǎng)，飲用水與飼料均進(jìn)行消毒后供實(shí)驗(yàn)大鼠自由進(jìn)食。

1.2主要試劑 兔源織織NF-κB/p65單克隆抗體(CST公司)；兔源核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)單克隆抗體(Abcam公司)；卡非佐米(艾酶捷科技有限公司)；完全弗氏佐劑(北京博蕾德生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎建模及給藥 建模：參照陳璐璐等[6]研究中的方法造模，30只大鼠正常喂養(yǎng)1周后，正常組10只SD大鼠不予處理，對(duì)剩余20只大鼠進(jìn)行建模。對(duì)模型組大鼠及抑制劑組大鼠右后足進(jìn)行消毒后注射完全弗氏佐劑，每只0.1 mL，1周后在模型組、抑制劑組大鼠右后足進(jìn)行消毒，消毒后注射不完全弗氏佐劑進(jìn)行強(qiáng)化免疫，造模11 d后，當(dāng)各組造模大鼠耳部、尾部結(jié)節(jié)等部位出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)時(shí)，視為造模成功。最終建模成功18只，隨機(jī)分為模型組9只，抑制劑組9只。給藥：抑制劑組SD大鼠在建模成功第1天起每隔2天對(duì)大鼠腹腔內(nèi)注射第二代蛋白酶體抑制劑(溶解于0.5 mL DMSO溶劑中的1.5 mL卡非佐米)。

1.3.2關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無紅腫為0分，小趾關(guān)節(jié)輕度紅腫為1分，小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹為2分，踝關(guān)節(jié)下指甲腫脹為3分，所有指甲、關(guān)節(jié)腫脹為4分。按此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠四肢病變程度進(jìn)行評(píng)價(jià)并積分，計(jì)算關(guān)節(jié)炎評(píng)分。

1.3.3標(biāo)本制備及染色 實(shí)驗(yàn)第28天時(shí)，全身麻醉處死各組大鼠，在大鼠股動(dòng)脈處取15 mL股動(dòng)脈血，離心取得上清液，于-80 ℃冰箱保存待檢，另取得大鼠踝關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)滑膜組織，置于-80 ℃冰箱保存待檢。取大鼠踝關(guān)節(jié)液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的乙醇中。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用1% HCL-乙醇分化處理30 s，清洗之后使用1%伊紅染色，使用乙醇進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.4檢測方法 采用透射比濁法[8]檢測TNF-α、IL-6、IL-10、ALT、AST水平，采用Western blot法檢測NF-κB/p65、IκBα蛋白表達(dá)情況，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測SD大鼠IgA、IgM水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理圖 正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織健全，表面較平整光滑，關(guān)節(jié)滑膜組織中未見充血、水腫、增生的現(xiàn)象，未見炎癥細(xì)胞的侵入；模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織厚度增加，滑膜組織絨毛狀增生，并伴有大量的炎癥細(xì)胞入侵；抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞增生減少，有著少量的炎癥細(xì)胞入侵。見圖1。

注：A為正常組；B為模型組；C為抑制劑組。

2.2抑制劑組與模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎評(píng)分比較 建模后第7、14、21天，抑制劑組大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 抑制劑組與模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎評(píng)分分]

2.3各組大鼠體內(nèi)炎癥因子水平比較 與正常組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6水平上升，IL-10水平下降，且抑制劑組大鼠TNF-α、IL-10水平下降，IL-6水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，抑制劑組大鼠TNF-α、IL-6水平下降，IL-10水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65、IκBα蛋白表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65水平上升，IκBα水平下降，且抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65水平下降，IκBα水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65水平下降，IκBα水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、4。

注：A為正常組；B為模型組；C為抑制劑組。

2.5各組大鼠IgA、IgM水平比較 與正常組相比，模型組大鼠IgA、IgM水平上升，且抑制劑組大鼠IgA、IgM水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組大鼠IgA、IgM水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.6各組大鼠ALT、AST水平比較 與正常組相比，模型組大鼠ALT、AST水平上升，且抑制劑組大鼠ALT水平下降，AST水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組大鼠ALT、AST水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆宰陨砻庖咝约膊?，該病在任何年齡段均可發(fā)病，以20～50歲為主，女性發(fā)病率是男性的2～3倍[9]。蛋白酶抑制劑在廣義上指的是與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)的結(jié)合，使得蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質(zhì)[10]。第二代蛋白酶抑制劑相較于一代蛋白酶抑制劑而言，具有抗多發(fā)性骨髓瘤的高效性和低毒性的特點(diǎn)?？ǚ亲裘鬃鳛榈诙鞍酌敢种苿?，是一種特異性、不可逆的靶向抑制劑,適用于多發(fā)性骨髓瘤患者的治療[11]。

臨床研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體炎癥有著密切關(guān)聯(lián)[12-13]。TNF-α、IL-6、IL-10是臨床較為常用的炎癥因子，通過檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平能夠較為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)展情況[14]。當(dāng)關(guān)節(jié)滑膜周圍的巨噬細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，炎性介質(zhì)配合促炎因子、生長因子、趨化因子等，能夠引發(fā)炎癥，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)出現(xiàn)損傷。張傳英等[15]的研究顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠炎性標(biāo)志物水平出現(xiàn)異常，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠進(jìn)行有效的治療，能夠調(diào)控炎性標(biāo)志物水平，抑制機(jī)體炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，采用第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行治療后，大鼠TNF-α、IL-6水平下降，IL-10水平上升，說明TNF-α、IL-6、IL-10有著密切關(guān)系，對(duì)TNF-α、IL-6、IL-10進(jìn)行檢測有助于判斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展情況。

ALT存在于各種細(xì)胞內(nèi)，以肝臟、心臟組織細(xì)胞為主，當(dāng)其發(fā)生病變時(shí)，ALT水平會(huì)急劇增加[16]。AST主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌等組織中[17]。肖燕等[18]的研究顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠ALT、AST水平異常上升，進(jìn)行有效治療后，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠ALT、AST水平降低。本研究結(jié)果顯示，使用第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠進(jìn)行治療后，大鼠ALT、AST水平下降，與上述研究一致，說明使用第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療效果較好。

相關(guān)資料顯示，NF-κB在眾多炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用，也是炎性反應(yīng)調(diào)控機(jī)制中的中心環(huán)節(jié)[19]。NF-κB參與多種細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控，如抗凋亡蛋白、Toll受體、細(xì)胞因子受體及誘導(dǎo)型氧化氮合酶的表達(dá)。有研究表明，NF-κB的激活、失活與泛素-蛋白酶體通路之間存在密切聯(lián)系，在免疫細(xì)胞炎性反應(yīng)機(jī)制研究中是關(guān)注熱點(diǎn)[20]。泛素系統(tǒng)通過蛋白酶體降解NF-κB的抑制蛋白IκB，參與調(diào)節(jié)免疫炎癥細(xì)胞NF-κB的激活和再循環(huán)。NF-κB通常以無活性的形式存在于未受刺激的細(xì)胞內(nèi)，其能夠調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠進(jìn)行治療，能夠激活I(lǐng)κBα，抑制NF-κB/p65通路。

綜上所述，利用第二代蛋白酶體抑制劑對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行治療，能夠通過抑制NF-κB/p65通路，調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的炎癥因子水平，降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，效果顯著。