自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達和臨床意義*

宋鵬書，張燕華，張奕梅，莫梅珍，何 升，張 莉

廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣西南寧 530003

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指3次或3次以上發(fā)生在20周之內(nèi)的妊娠失敗，發(fā)生率高達3%～5%[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜多樣，可能與遺傳因素、感染因素、免疫學(xué)因素、內(nèi)分泌因素等有關(guān)，且約50%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)[2]。

自噬是一種高度保守的細胞行為，其通過泛素蛋白酶系統(tǒng)維持細胞內(nèi)穩(wěn)定，是由雙層膜性結(jié)構(gòu)對細胞內(nèi)成分進行包裹，之后通過與溶酶體結(jié)合從而將包裹的內(nèi)容物進行分解、再利用的過程[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬反應(yīng)活性失調(diào)對妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生存在不可忽視的影響[5]。但有關(guān)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與自噬的相互關(guān)系報道較為少見。本研究探討了自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、p62在URSA患絨毛組織中的表達情況，分析URSA結(jié)局與絨毛組織發(fā)生自噬反應(yīng)的相關(guān)性，旨在研究URSA的發(fā)生機制，為進一步尋找新的臨床干預(yù)方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年3-7月在本院婦產(chǎn)科行清宮術(shù)URSA患者及行人工流產(chǎn)術(shù)的正常妊娠者分別作為URSA組和對照組，每組10例。兩組患者診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》。URSA組平均年齡(32±6)歲，平均孕周(10±2)周，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)超聲檢查子宮發(fā)育正常；(2)夫婦染色體核型檢查正常；(3)甲狀腺功能檢查正常；(4) 無血栓形成傾向；(5)自然流產(chǎn)次數(shù)≥3次；(6)排除免疫及感染因素影響。對照組平均年齡(30±4)歲，平均孕周(10±2)周，無不良孕產(chǎn)史，正常妊娠次數(shù)≥1次。本研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象自愿簽署知情同意書。

1.2主要試劑 多聚甲醛固定液購自Sigma公司；兔抗人LC3單抗隆抗體購自CST公司；兔抗人p62多克隆抗體購自SAB公司；兔抗人β-actin多克隆抗體購自北京博奧森公司；BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗兔熒光二抗購自Abcam公司；顯影液購自Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1絨毛組織留取 在人工流產(chǎn)術(shù)或清宮術(shù)術(shù)中妊娠組織清出后 3 min內(nèi)，迅速于無菌狀態(tài)下挑選絨毛組織，用無菌生理鹽水沖洗干凈，將其分為三份：兩份分別置于已備制好的體積分數(shù)為4%的多聚甲醛液中固定 24 h，用于HE染色和免疫組化實驗；另一份置于凍存管中，將其迅速放入液氮內(nèi)，然后移至-80 ℃冰箱保存，用于目的蛋白表達量檢測。

1.3.2絨毛組織病理學(xué)觀察 取固定24 h的絨毛組織，組織塊脫水，石蠟包埋，切成厚度4 μm薄片，放入37 ℃溫水使切片伸展，貼至載玻片上，依次浸入二甲苯、乙醇脫蠟，蒸餾水沖洗，然后將載玻片放入蘇木精溶液中染色，流水沖洗，放入37 ℃溫水中進行返藍，晾干，中性樹膠封固保存，電子顯微鏡觀察染色情況。

1.3.3Western blot檢測絨毛組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、p62的表達 取-80 ℃冰箱保存的絨毛組織，稱質(zhì)量后剪碎放入EP管中，用電動勻漿機研磨碎，加入組織裂解液，放在冰盒上裂解40 min，4 ℃，12 000×g離心20 min，提取組織總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離樣品蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST沖洗3次，每次5 min。加入LC3和p62單克隆一抗(1∶500)4 ℃搖晃孵育過夜，TBST沖洗3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，然后于顯影液中孵育5 min，上機檢測。采用Quantity One軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.3.4免疫組化實驗檢測絨毛組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達 取固定24 h的絨毛組織，組織塊脫水，石蠟包埋，切成厚度5 μm薄片，放入37 ℃溫水表面便于切片伸展容易貼到載玻片上，再依次浸入二甲苯、乙醇脫蠟，高壓修復(fù)，3%過氧化氫溶液中孵育。用PAP筆在組織切邊畫圈，然后滴加封閉液。一抗LC3和p62(1∶200)孵育過夜，二抗孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色5 min。蘇木精染色1 min，分化返藍，梯度乙醇脫水，樹膠封片，電子顯微鏡觀察陽性面積大小。

2 結(jié) 果

2.1兩組絨毛組織的病理學(xué)結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，對照組絨毛組織內(nèi)部細胞形態(tài)飽滿，細胞核呈梭子型，絨毛組織外部完整，URSA組絨毛組織內(nèi)部細胞出現(xiàn)皺縮，顏色暗紅，細胞之間出現(xiàn)斷離，絨毛組織有破損。見圖1。

圖1 兩組流產(chǎn)絨毛組織HE染色結(jié)果(×200)

2.2Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62在流產(chǎn)絨毛組織中的表達 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，URSA組的絨毛組織中LC3-Ⅱ 的蛋白表達量顯著增加；同時，p62蛋白的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Western blot檢測結(jié)果；B為蛋白定量分析;與對照組比較，aP<0.05。

2.3免疫組化實驗分析自噬相關(guān)蛋白LC3和p62在絨毛組織中的表達 免疫組化實驗結(jié)果顯示，LC3和p62蛋白主要定位于細胞質(zhì)中。與對照組相比，URSA組LC3蛋白表達量上升， p62蛋白表達量降低，結(jié)果與Western blot 檢測結(jié)果一致。見圖3。

圖3 LC3和p62蛋白在兩組絨毛組織中的表達情況(×200)

3 討 論

流產(chǎn)常發(fā)生在妊娠早期，其發(fā)生率隨孕婦年齡的增長而升高。導(dǎo)致流產(chǎn)常見的因素包括免疫功能障礙、染色體異常、內(nèi)分泌疾病及子宮畸形等。URSA是流產(chǎn)中的一種特殊類型，近年因其發(fā)病率呈上升趨勢而受到廣泛關(guān)注[6]。目前，URSA的發(fā)病機制尚不明確，且病因復(fù)雜，臨床治療尚處于探索階段，因此成為婦產(chǎn)科領(lǐng)域的研究重點與難點。

卵母細胞受精、胚胎植入前后的發(fā)育，以及妊娠期并發(fā)癥均涉及自噬的誘導(dǎo)，當(dāng)滋養(yǎng)細胞早期處于缺氧和營養(yǎng)有限的環(huán)境下，自噬對其有重要的保護作用，利于其適應(yīng)早期發(fā)育的微環(huán)境[7-8]。雖然自噬可以為細胞修復(fù)損傷的細胞器提供能量，但當(dāng)其超過一定限度后，也可能破壞細胞結(jié)構(gòu)，影響能量供應(yīng)，引發(fā)自噬性細胞死亡[9-10]。近年研究顯示，與正常妊娠孕婦胎盤絨毛組織相比，流產(chǎn)、子癇前期、胎兒生長受限、妊娠期糖尿病等病理妊娠的孕婦胎盤組織中均出現(xiàn)自噬過程受損[11-12]。此外，KHIDER等[13]研究發(fā)現(xiàn)，無論是胎兒早產(chǎn)還是足月分娩，均與胎盤自噬活性降低有關(guān)。分娩實際上是一個炎癥持續(xù)過程，無論早產(chǎn)還是足月分娩，自噬活性的降低都會導(dǎo)致炎癥因子清除不足，從而導(dǎo)致促炎細胞因子釋放過多，最終引發(fā)不良分娩結(jié)局[14]。

細胞自噬是多種自噬相關(guān)基因和關(guān)鍵蛋白參與的動態(tài)過程，可通過這些分子的表達水平來評估自噬活性。在自噬循環(huán)過程中，LC3分子經(jīng)酶切反應(yīng)后形成胞質(zhì)型LC3-Ⅰ，后與磷脂酰乙醇胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)型LC3-Ⅱ，該亞型附著在自噬體上直至與溶酶體融合形成自噬溶酶體[15-16]。LC3-Ⅱ是監(jiān)測自噬水平穩(wěn)定可靠的特異性標(biāo)志物，其含量在一定程度上反映了自噬體的數(shù)量。p62也是自噬反應(yīng)發(fā)生過程中的重要銜接分子，其水平變化與自噬強弱呈負相關(guān)，常與 LC3共同用于判斷自噬反應(yīng)活性[17]。本研究中，Western blot和免疫組化實驗結(jié)果均顯示，與正常妊娠孕婦相比，URSA患者的絨毛組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ上調(diào)，p62蛋白下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示在URSA患者絨毛組織中自噬水平增強。推測自噬與URSA發(fā)生的關(guān)系可能為:(1)滋養(yǎng)層細胞受到環(huán)境強烈刺激時，細胞中的自噬水平過度會直接導(dǎo)致自噬性細胞死亡;(2)過度自噬可通過自噬溶酶體途徑降解細胞中生存素等抗凋亡因子，導(dǎo)致細胞凋亡，從而引發(fā)URSA。自噬是一把“雙刃劍”。在妊娠早期滋養(yǎng)層細胞處于相對缺氧的環(huán)境中，缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，細胞內(nèi)的自噬體通過收集受損、老化的細胞器，產(chǎn)生新的能量以維持細胞正常增殖分化。如果滋養(yǎng)層細胞受的刺激過度，同樣會使細胞自噬反應(yīng)激烈，使細胞中的細胞器大量受損從而使細胞死亡，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。謝冰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1 mRNA及蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平在稽留流產(chǎn)的絨毛及蛻膜組織中均上調(diào)，提示細胞自噬參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生，其主要原因是絨毛及蛻膜組織發(fā)生炎性反應(yīng)。王婧瑤[19]研究發(fā)現(xiàn)，IGF2在胚胎停止發(fā)育絨毛組織中表達降低，mTOR通路調(diào)節(jié)自噬的作用缺失，導(dǎo)致自噬活動紊亂，進而使胚胎停止發(fā)育。本研究結(jié)果提示，自噬相關(guān)蛋白在URSA患者絨毛組織中高度表達也有可能是妊娠早期的絨毛組織發(fā)生炎性反應(yīng)，絨毛組織細胞通過自噬過度激活以應(yīng)對炎性反應(yīng)，最終使得細胞發(fā)生自噬性死亡。

本研究為URSA發(fā)病機制的闡明提供了一定理論依據(jù)，可考慮將自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、p62作為URSA早期診斷的標(biāo)志物。但復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的致病原因復(fù)雜，還需進一步深入研究。