癲癇患兒血清α-突觸核蛋白和熱休克蛋白70的表達(dá)及臨床意義*

黃凌鋒，廉榮鎮(zhèn)，肖 能，歐陽(yáng)純，陳 薇

郴州市第一人民醫(yī)院兒科，湖南郴州 423000

癲癇是臨床常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在兒童中患病率較高，我國(guó)癲癇每年患病率約為7%，其中10歲以下兒童占比達(dá)3.45%[1]。癲癇具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，并伴有呼吸系統(tǒng)紊亂、循環(huán)系統(tǒng)紊亂、肌肉抽搐等表現(xiàn)，對(duì)神經(jīng)元造成的損害較大，可影響腦代謝功能，隨著神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變，甚至?xí)?dǎo)致認(rèn)知障礙[2]。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白(α-Syn)可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)受損，從而破壞神經(jīng)細(xì)胞功能，可能引起認(rèn)知障礙[3]。因此，臨床有理由推測(cè)，α-Syn可能與癲癇患兒認(rèn)知障礙發(fā)生有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白(HSP)可能與癲癇進(jìn)展有關(guān)，例如，癲癇患者神經(jīng)細(xì)胞受損后，其變性蛋白質(zhì)對(duì)熱休克蛋白70(HSP70)生成有誘導(dǎo)作用[4]。目前，臨床對(duì)癲癇患兒α-Syn、HSP70的研究仍處于初步探索階段，其具體作用機(jī)制尚未明確?；诖耍狙芯坑^察癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認(rèn)知功能、事件相關(guān)電位及血清炎癥細(xì)胞因子的關(guān)系，以期為臨床診療提供思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年8月至2019年8月收治的癲癇患兒105例作為癲癇組。癲癇診斷參考《小兒癲癇的診斷與治療》[5]：(1)臨床發(fā)作。(2)腦電圖檢查提示癇樣放電。①每天癲癇發(fā)作>3次，提示癲癇頻發(fā)；②發(fā)作持續(xù)時(shí)間≥30 min或短期連續(xù)間斷發(fā)病≥30 min，但間歇期未達(dá)到發(fā)病前狀態(tài)，提示癲癇持續(xù)狀態(tài)；③無(wú)上述特征的癲癇患兒即為非頻發(fā)非持續(xù)狀態(tài)。癲癇組男63例，女42例；年齡4～12歲，平均(8.72±3.25)歲；身高130～147 cm，平均(138.04±3.96)cm；體質(zhì)量24～33 kg，平均(28.92±3.26)kg。根據(jù)患兒癲癇類(lèi)型，將癲癇組患兒分為癲癇1組(癲癇頻發(fā))24例，癲癇2組(癲癇持續(xù)狀態(tài))38例，癲癇3組(非頻發(fā)非持續(xù)狀態(tài))43例。另選取在本院進(jìn)行體檢的健康兒童68例作為健康對(duì)照組，其中男37例，女31例；年齡5～13歲，平均(9.09±3.65)歲；身高131～145 cm，平均(137.53±4.48)cm；體質(zhì)量23～35 kg，平均(29.08±4.72)kg。兩組性別、年齡、身高、體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2納入、排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)。癲癇組：①年齡≤15歲，符合上述關(guān)于癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)體檢，未見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)陽(yáng)性體征；③原發(fā)性癲癇，未見(jiàn)癲癇相關(guān)并發(fā)癥；④病例資料完整；⑤監(jiān)護(hù)人對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。健康對(duì)照組：①身體健康狀況良好；②性別、年齡等基線資料與癲癇組匹配；③監(jiān)護(hù)人對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前服用過(guò)抗癲癇藥物者；②因顱腦外傷等其他非癲癇因素引起的認(rèn)知障礙者；③因腦出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等誘發(fā)的繼發(fā)性癲癇者；④近期使用過(guò)免疫抑制劑、激素類(lèi)藥物者；⑤重度營(yíng)養(yǎng)不良者；⑥肝、腎、心等臟器嚴(yán)重受損者。

1.3儀器與試劑 主要試劑：人C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)試劑(北京世紀(jì)沃德生物科技有限公司)、人α-Syn檢測(cè)試劑(上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司)、人HSP70檢測(cè)試劑(美國(guó)eBioscience)以及血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β，成都超九八生物)、白細(xì)胞介素-6(IL-6，上海紀(jì)寧生物)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，美國(guó)eBioscience公司)檢測(cè)試劑。主要儀器：全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞醫(yī)療，MR-96A)、誘發(fā)電位儀(上海企晟醫(yī)療器械有限公司，Nicolet EDX型)。

1.4方法

1.4.1檢測(cè)方法 健康對(duì)照組在體檢當(dāng)日接受各項(xiàng)檢查，癲癇組在治療前進(jìn)行檢查。(1)血清指標(biāo)檢測(cè)：在受試者空腹?fàn)顟B(tài)下，采集4 mL靜脈血，3 000 r/min離心20 min，離心半徑為15 cm，分離血清，存放于-70 ℃低溫冰箱待測(cè)。采用免疫比濁法檢測(cè)血清CRP水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。(2)事件相關(guān)電位P300檢查：經(jīng)誘發(fā)電位儀檢測(cè)，設(shè)置非靶刺激、靶刺激2個(gè)等級(jí)，頻率分別為750、2 000 Hz，將二者組成刺激序列。受試者選擇坐位，通過(guò)耳機(jī)給聲的形式誘發(fā)，根據(jù)國(guó)際電生理學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行檢測(cè)，記錄P300波幅、P300潛伏期。(3)認(rèn)知功能評(píng)估：參考中國(guó)韋氏兒童智力量表(C-WISC)[7]評(píng)價(jià)，該量表含有言語(yǔ)測(cè)驗(yàn)、操作測(cè)驗(yàn)2個(gè)部分，前者包括領(lǐng)悟、算術(shù)、知識(shí)、詞匯、數(shù)字廣度、相似，后者包括數(shù)字符號(hào)、積木、拼圖、填圖、排列。相對(duì)有效范圍為55～145分，分值越高，提示智力越好。

1.4.2治療方法 癲癇組在接受上述檢查后，給予抗癲癇治療，其中有54例經(jīng)丙戊酸鈉(上海青平藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020728)治療，劑量10～20 mg/(kg·d)，療程3～5 d。51例采用卡馬西平(北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11022279 )治療，劑量10～40 mg/(kg·d)，療程7～14 d。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清α-Syn、HSP70及炎癥因子水平比較 癲癇組血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清α-Syn、HSP70及炎癥因子水平比較

2.2兩組C-WISC評(píng)分、事件相關(guān)電位P300比較 癲癇組C-WISC評(píng)分低于健康對(duì)照組，而P300潛伏期較健康對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組P300波幅比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組C-WISC評(píng)分、事件相關(guān)電位比較

2.3癲癇1、2、3組患兒α-Syn、HSP70及認(rèn)知評(píng)分、事件相關(guān)電位、炎癥因子比較 癲癇1組、癲癇2組的血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均高于癲癇3組，且P300潛伏期長(zhǎng)于癲癇3組，而癲癇1組、癲癇2組的C-WISC評(píng)分低于癲癇3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中癲癇2組血清IL-6、CRP、TNF-α水平低于癲癇1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，癲癇1、2、3組患兒P300波幅比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 癲癇1、2、3組患兒α-Syn、HSP70及認(rèn)知評(píng)分、事件相關(guān)電位、炎癥因子比較

2.4癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認(rèn)知功能評(píng)分、事件相關(guān)電位、炎癥因子的相關(guān)性 Pearson線性相關(guān)分析顯示，血清α-Syn、HSP70與C-WISC評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與P300潛伏期及血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05)，二者與P300波幅無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認(rèn)知功能評(píng)分、事件相關(guān)電位、炎癥因子的相關(guān)性

續(xù)表4 癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認(rèn)知功能評(píng)分、事件相關(guān)電位、炎癥因子的相關(guān)性

3 討 論

癲癇是兒童中的常見(jiàn)病，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能影響較大，在這類(lèi)患兒中，30%～40%的病例出現(xiàn)智力損害，癲癇后認(rèn)知功能障礙發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，是多因素作用的結(jié)果，包括發(fā)作頻次、病灶部位、癲癇類(lèi)型、抗癲癇藥應(yīng)用情況等[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，α-Syn可通過(guò)對(duì)線粒體外膜進(jìn)行干擾，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)受損，誘發(fā)氧化應(yīng)激，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能有損害作用[9]。這提示α-Syn可能對(duì)癲癇后神經(jīng)功能損害有影響。HSP70是熱休克蛋白的重要組成部分，其在健康腦組織中含量較少，而在癲癇發(fā)作時(shí)可見(jiàn)HSP70聚集[10]。故臨床可考慮將血清α-Syn、HSP70用于癲癇患兒的病情評(píng)估，但現(xiàn)階段臨床對(duì)二者在癲癇中的作用機(jī)制尚未完全明確，仍需大量研究予以論證。

本研究結(jié)果顯示，與健康兒童相比，癲癇患兒的血清α-Syn、HSP70增高(P<0.05)。α-Syn在神經(jīng)組織內(nèi)存在表達(dá)，對(duì)腦神經(jīng)元有調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)改變可能與其異常聚集存在關(guān)聯(lián)，而氧化應(yīng)激能促進(jìn)α-Syn聚集[11]。α-Syn在表達(dá)水平較低時(shí)，能保護(hù)神經(jīng)元，可發(fā)揮一定的抗過(guò)氧化氫功能，但其表達(dá)水平較高時(shí)，則會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，致神經(jīng)功能受損[12]。HSP70能與聚集、錯(cuò)折疊、新生的蛋白質(zhì)結(jié)合，解離某類(lèi)蛋白質(zhì)，使不溶性聚集物減少，在病理情況下釋放入血。在癲癇發(fā)病后，腦細(xì)胞能對(duì)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行誘導(dǎo)，這種應(yīng)激反應(yīng)主要由蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)變性等機(jī)制所致，而變性蛋白質(zhì)能誘導(dǎo)HSP70生成[13]。因此，癲癇后血清HSP70水平增高。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患兒的血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均較健康兒童增高，提示癲癇患兒機(jī)體存在炎癥。研究證實(shí)，炎癥參與了癲癇病情進(jìn)展，其能將機(jī)體抗癲癇途徑阻斷，導(dǎo)致癲癇加重，促使患兒處于持續(xù)癲癇狀態(tài)，加重神經(jīng)元損害[14]。這與本研究結(jié)論基本一致，因此，在癲癇的治療中，臨床需注重抗炎處理，緩解病情。

本研究結(jié)果提示，與健康兒童相比，癲癇患兒的C-WISC評(píng)分下降，而P300潛伏期延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P300電位能反映癲癇患兒的認(rèn)知損害程度，潛伏期越長(zhǎng)，表明大腦感知信息的能力越弱，出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)障礙以及信息加工能力損害[15]。本研究顯示，癲癇患兒P300潛伏期延長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)其存在認(rèn)知障礙。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與非頻發(fā)非持續(xù)狀態(tài)患兒相比，癲癇頻發(fā)、癲癇持續(xù)狀態(tài)患兒的血清α-Syn、HSP70水平更高(P<0.05)。α-Syn能與多巴胺結(jié)合生成多巴胺醌-突觸核蛋白，導(dǎo)致神經(jīng)元毒性增強(qiáng)[16]。而癲癇頻發(fā)、癲癇持續(xù)狀態(tài)者因癲癇發(fā)作頻繁，間歇時(shí)間短，對(duì)神經(jīng)元造成的損害更大，可能促進(jìn)血清α-Syn表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。HSP70對(duì)受損細(xì)胞有保護(hù)作用，但在應(yīng)激狀態(tài)下，其表達(dá)反而增高，原因可能在于，在出現(xiàn)應(yīng)激損傷后，機(jī)體啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生應(yīng)激性HSP70表達(dá)增高[17]。此外，本研究結(jié)果顯示，3組患兒，癲癇3組的炎癥因子水平最低，C-WISC評(píng)分最高，P300潛伏期最短，原因可能在于該組患兒癲癇程度最輕，其所遭受的神經(jīng)元毒性最弱，故機(jī)體狀態(tài)相對(duì)較好。

本研究結(jié)果顯示，血清α-Syn、HSP70水平與C-WISC評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與P300潛伏期及血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)。α-Syn呈高表達(dá)時(shí)，可上調(diào)Bax表達(dá)，導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性增強(qiáng)，對(duì)線粒體細(xì)胞色素C的大量釋放有促進(jìn)作用，可使細(xì)胞凋亡，加重炎性反應(yīng)，損害認(rèn)知功能，而其低表達(dá)可發(fā)揮抗過(guò)氧化氫作用，對(duì)神經(jīng)元有一定保護(hù)作用[18]。HSP70在海馬、丘腦等部位表達(dá)水平較高，上述區(qū)域均與認(rèn)知功能密切相關(guān)，在出現(xiàn)影響腦功能的疾病時(shí)，可導(dǎo)致與認(rèn)知功能相關(guān)區(qū)域受損，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，損害認(rèn)知功能，在這種情況下，可能致HSP70表達(dá)應(yīng)激性增高[19]。臨床可將調(diào)節(jié)癲癇患兒的血清α-Syn、HSP70水平作為治療新思路，改善預(yù)后。蘇玉強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知障礙大鼠的HSP70水平上升時(shí)，其神經(jīng)元損害減輕。而本研究結(jié)果提示，在癲癇患兒認(rèn)知功能受損情況下，HSP70反而出現(xiàn)應(yīng)激性增高，分析原因可能與HSP70在發(fā)病后不同階段的表達(dá)差異有關(guān)，或者與導(dǎo)致認(rèn)知障礙的原發(fā)因素有關(guān)，這有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，癲癇患兒的血清α-Syn、HSP70水平較健康兒童明顯增高，且二者變化受認(rèn)知功能、P300潛伏期及機(jī)體炎癥的影響。本研究局限性在于樣本量較小，未來(lái)還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的研究。