AR基因CAG重復(fù)序列拷貝數(shù)與男性HBV相關(guān)性HCC臨床特征關(guān)系研究

羅伊凡,鄭慶玲,顧棟樺,姜夢婷,潘曉英,王曉冉,蘭 嵐,張 婷

(1.湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院 病理科，江蘇 蘇州 215153)

雄激素受體(AR)基因第一外顯子中含有兩個(gè)三核苷酸重復(fù)序列，其由(CAG)n編碼的多聚谷氨酸(polyQ)和由(GGC)n編碼的多聚甘氨酸(polyG)組成，不同個(gè)體間其長度存在多態(tài)性.研究發(fā)現(xiàn)，AR基因第一外顯子CAG重復(fù)序列長度與肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性[1-7].而AR基因第一外顯子CAG重復(fù)序列長度與AR基因的mRNA相對表達(dá)水平、HBV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性尚需明確.此外，CAG重復(fù)序列數(shù)在乙型肝炎、HBV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular cancer，HCC)及癌旁組織中的差異亦需進(jìn)一步闡明.因AR基因是雄性激素作用的中介物質(zhì)，為避免性別對本研究的影響，本文選取男性HBV相關(guān)性HCC及男性乙型肝炎患者展開研究.

1 材料與方法

1.1 研究對象的選擇與分組

收集2011—2017年在湖州師范學(xué)院附屬中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的83例男性HBV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本，包括癌組織及癌旁組織.部分組織標(biāo)本離體后立即置于液氮中冷凍保存，剩余組織標(biāo)本用4%的中性福爾馬林固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋.入組的HCC患者術(shù)前均未接受過放、化療及生物治療，無飲酒史，無其它類型的肝炎病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)合并感染，年齡為33～75歲，中位年齡為46歲.另外,選取45例男性慢性乙型肝炎患者的肝穿刺石蠟包埋組織作為對照組.

1.2 組織樣本中核酸的提取

石蠟包埋組織DNA的提取：將經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切成厚度為4 μm的切片，經(jīng)二甲苯(15 min×2次)和無水乙醇(15 min×2次)脫蠟，空氣干燥，然后用微量組織DNA抽提試劑盒(QIAGEN公司，德國)進(jìn)行抽提，抽提的DNA樣本于-20 ℃凍存待用.

新鮮組織RNA的提取：將組織用液氮冷凍研磨成組織勻漿，加入Trizol試劑(上海生工公司)，并參照說明書進(jìn)行操作獲得組織的總RNA.總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測.

1.3 AR基因CAG重復(fù)序列數(shù)的檢測

AR基因第一外顯子CAG重復(fù)序列的擴(kuò)增引物：上游引物為5’-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3’，下游引物為5’-ATG GGC TTG GGG AGA ACC ATC CTC-3’，產(chǎn)物大小為167 bp+3n；上游引物5’末端均標(biāo)記6-羧基熒光素.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃45 s，72 ℃45 s，經(jīng)38個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，至4 ℃結(jié)束；以無菌去離子水代替模板的陰性對照，以相應(yīng)的陽性標(biāo)本作為陽性對照.PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后，觀察目的條帶，用ABI 377 DNA測序儀(ABI公司,美國)進(jìn)行測序，并用Genescan3.7軟件分析PCR產(chǎn)物的大小.

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測AR基因的mRNA相對表達(dá)水平

AR基因的上游引物為5’-TAC CAG CTC ACC AAG CTC CT-3’，下游引物為5’-GCT TCA CTG GGT GTG GAA AT-3’，產(chǎn)物長度為195 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的上游引物為5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’，下游引物為5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’，產(chǎn)物長度為226 bp.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

檢測AR基因的mRNA相對表達(dá)水平：采用實(shí)時(shí)熒光定量SYBER Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司，日本)，加樣體系按試劑盒說明書進(jìn)行操作，PCR反應(yīng)在Rotorgen 3000 real-time PCR儀(CorbettLife Science公司，澳大利亞)中完成.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，經(jīng)50個(gè)循環(huán)，隨機(jī)附帶軟件計(jì)算Ct值和拷貝數(shù)，AR基因的 mRNA相對表達(dá)水平=AR基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù).

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間重復(fù)序列的比較采用t檢驗(yàn)，CAG重復(fù)序列數(shù)與AR基因的mRNA相對表達(dá)水平的相關(guān)性用Pearson’s相關(guān)性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 HBV相關(guān)性HCC組織中AR基因CAG重復(fù)序列的多態(tài)性

在所有病例中，含CAG重復(fù)序列的AR基因片段擴(kuò)增成功，見圖1.CAG片段的長度為200～248 bp.

注：M為DL2000；1～12為檢測樣本.圖1 PCR擴(kuò)增CAG重復(fù)序列的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of CAG repeats amplified by PCR

83例HBV相關(guān)性HCC組織中CAG重復(fù)序列的個(gè)數(shù)在11～27之間(平均值為19.95±2.75)，其中小于17個(gè)的有8例，17個(gè)的有5例，18個(gè)的有6例，19個(gè)的有13例，20個(gè)的有12例，21個(gè)的有20例，22個(gè)的有8例，大于22個(gè)的有11例.具體見圖2.

圖2 肝細(xì)胞肝癌組織中AR基因CAG重復(fù)序列數(shù)分布Fig.2 Distribution of CAG repetitive sequences of AR gene in HCC

本文對83例HBV相關(guān)性HCC患者的肝癌組織和癌旁肝組織進(jìn)行AR多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)序列數(shù)在8例患者的肝癌組織中出現(xiàn)變異，其中5例男性患者的CAG重復(fù)序列數(shù)減少(23→20，25→23，21→20，22→19，21→19)，3例男性患者的CAG重復(fù)序列數(shù)增多(21→23，20→21，21→22).具體見圖3.

圖3 肝細(xì)胞肝癌組織中AR基因CAG重復(fù)序列變異測序結(jié)果Fig.3 Sequencing of CAG repeat sequence variation of AR gene in HCC

如圖3(a)所示,相對癌旁肝組織中CAG重復(fù)序列(236 bp)，肝癌組織中CAG重復(fù)序列出現(xiàn)新的縮短的227 bp(n=20)片段；如圖3(b)所示,相對癌旁肝組織中CAG重復(fù)序列(213 bp)，肝癌組織中CAG重復(fù)序列出現(xiàn)新的增長的219 bp(n=17)片段.

2.2 慢性乙型肝炎肝組織中AR基因CAG重復(fù)序列的多態(tài)性

45例慢性乙型肝炎肝組織中CAG重復(fù)序列的個(gè)數(shù)在12～31之間(平均值為22.41±3.69)，其中小于17個(gè)的有3例，17、19、20、26、28個(gè)的分別有2例，21、22個(gè)的分別有4例，23個(gè)的有7例，24個(gè)的有10例，25個(gè)的有5例，27、31個(gè)的分別有1例.慢性乙肝穿刺組織樣本中CAG重復(fù)序列的個(gè)數(shù)明顯高于肝細(xì)胞肝癌組織樣本(t=4.40,P<0.01)和肝癌癌旁肝組織樣本(t=4.41,P<0.01)，肝癌組織與癌旁肝組織中CAG重復(fù)序列的個(gè)數(shù)無明顯差異(t=0.87,P>0.05).

圖4 慢性乙型肝炎肝組織中CAG重復(fù)序列數(shù)分布Fig.4 Distribution of CAG repetitive sequences of AR gene in chronic hepatitis B liver tissues

2.3 肝癌組織中AR基因的mRNA相對表達(dá)水平與CAG重復(fù)序列的相關(guān)性

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝癌組織及癌旁肝組織中AR基因的mRNA相對表達(dá)水平，結(jié)果得出：肝癌組織中AR基因的mRNA相對表達(dá)水平為0.21±0.02，癌旁肝組織中AR基因的mRNA相對表達(dá)水平為0.22±0.08，兩者無明顯差異(t=0.43,P>0.05)；癌旁肝組織中CAG重復(fù)序列數(shù)與AR基因的mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.67,P<0.01),但肝癌組織中AR基因的mRNA相對表達(dá)水平與CAG重復(fù)序列數(shù)無相關(guān)性(r=0.12,P>0.05).

2.4 CAG重復(fù)序列的多態(tài)性與HBV相關(guān)性HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在HBV相關(guān)性HCC組織中，肝癌組織中CAG重復(fù)序列數(shù)與肝癌的病理分級、癌旁肝硬化情況、腫瘤復(fù)發(fā)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、感染乙肝病毒的基因型等指標(biāo)無明顯相關(guān)性，見表1.

表1 CAG重復(fù)序列的多態(tài)性與HBV相關(guān)性HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

AR基因位于X染色體的長臂Xq11-12，含8個(gè)外顯子，其第一外顯子區(qū)包含兩個(gè)三核苷酸重復(fù)序列(CAG)n和(GGC)n，這些重復(fù)序列在AR基因中表現(xiàn)為N端區(qū)域的多聚谷氨酸和多聚脯氨酸.AR基因序列的改變可能會引起結(jié)構(gòu)功能的變化，影響AR蛋白DNA結(jié)合功能和與配體結(jié)合功能的改變，從而引起受AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的下游基因表達(dá)的改變[8].因此，CAG和GGC重復(fù)序列在致病中的作用逐漸被研究者所重視.

Li等對2 000例經(jīng)病理證實(shí)的肝癌患者和對照組進(jìn)行了大規(guī)模的人群病例對照研究，發(fā)現(xiàn)AR基因CAG重復(fù)序列越長者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)越低，提示AR基因CAG重復(fù)序列數(shù)可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1].Yu等對男性肝癌患者血漿中DNA的分析發(fā)現(xiàn)，肝癌患者的CAG重復(fù)序列數(shù)明顯低于HBV攜帶者，并認(rèn)為CAG重復(fù)序列數(shù)小于20可能與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)[9].鐘雪松等研究發(fā)現(xiàn)，HBV陽性肝細(xì)胞癌(HCC)患者AR基因(CAG)n長度短于HBV陰性HCC患者[10].本研究通過對組織DNA中AR基因(CAG)n多態(tài)性的分析，發(fā)現(xiàn)男性HBV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌組織中AR基因的CAG重復(fù)序列平均數(shù)明顯低于男性乙型肝炎患者肝臟穿刺組織該序列平均數(shù)(t=4.40,P<0.01)，提示CAG重復(fù)序列數(shù)較低可能是HBV相關(guān)性肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素.

Yeh等研究發(fā)現(xiàn)，CAG重復(fù)序列長度與AR基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，CAG重復(fù)序列數(shù)較少可導(dǎo)致AR基因的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)[11].本研究發(fā)現(xiàn)癌旁肝組織中AR基因的表達(dá)與CAG重復(fù)序列數(shù)呈負(fù)相關(guān)性，表明長的CAG重復(fù)序列可能會下調(diào)AR基因的表達(dá).但在癌組織中AR基因的表達(dá)與CAG重復(fù)序列數(shù)未見明顯相關(guān)性，并且AR基因的表達(dá)在肝癌組織和癌旁肝組織之間無明顯差異.肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多種復(fù)雜因素參與的過程.隨著腫瘤的發(fā)展，肝癌組織中AR基因的表達(dá)可能受到其他因素影響而發(fā)生改變，癌旁肝組織中AR基因的表達(dá)與CAG重復(fù)序列數(shù)的相關(guān)性提示，AR基因的表達(dá)增高可能是促進(jìn)HBV相關(guān)性HCC發(fā)生的早期因素.

Yeh等還發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中AR基因(CAG)n可以發(fā)生變異，但這種變異主要表現(xiàn)為三核苷酸重復(fù)序列的改變[11].本研究中發(fā)現(xiàn)(CAG)n在8例患者的肝癌組織中出現(xiàn)變異，其中5例男性患者的CAG重復(fù)序列數(shù)減少，3例男性患者的CAG重復(fù)序列數(shù)增多.這種改變在肝癌中的臨床意義還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，男性HBV相關(guān)性肝癌組織中CAG重復(fù)序列數(shù)明顯低于HBV肝炎組，提示CAG重復(fù)序列數(shù)較低可能是慢性乙型肝炎患者發(fā)展成肝細(xì)胞肝癌的危險(xiǎn)因素；癌旁肝組織中AR基因的表達(dá)與CAG重復(fù)序列數(shù)呈負(fù)相關(guān)性；肝癌組織中的CAG重復(fù)序列會出現(xiàn)一定的變異，但其臨床意義還需進(jìn)一步研究.