WDR5在肺腺癌中的表達(dá)和預(yù)后提示作用研究

孫平 徐俊

肺癌是目前全球發(fā)病率最高的癌癥之一，也是全球癌因性死亡的首要原因之一[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，每年的新增肺癌病例數(shù)正在不斷增加[2]。通常臨床上將肺癌分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小細(xì)胞型肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）兩大類，其中NSCLC約占所有肺癌的75%～85%[3]。NSCLC主要包括腺癌、鱗癌、大細(xì)胞肺癌等組織學(xué)類型。近年來，腺癌的比例逐漸增多并超過了鱗癌成為最常見的肺癌組織類型，約占所有肺癌的40%[1]。肺腺癌的預(yù)后較差，全球每年因肺腺癌病死的患者數(shù)超過50萬例[4]。WD 重復(fù)域蛋白5（WD repeat-containingprotein 5,WDR5）是WD-40蛋白家族的主要成員[5]，參與各種細(xì)胞生理過程[6]。近年來有多項(xiàng)研究著眼于WDR5基因在腫瘤細(xì)胞中的作用，并取得了不小的進(jìn)展。如有研究發(fā)現(xiàn)在低氧刺激的腫瘤微環(huán)境乳腺癌細(xì)胞模型中，WDR5可誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[7]。另外，WDR5還在胃癌、結(jié)直腸癌、白血病、前列腺癌等[8-11]多種腫瘤中通過多種途徑發(fā)揮作用。目前，國(guó)內(nèi)外尚鮮見涉及肺腺癌組織中WDR5表達(dá)及其臨床意義的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。因此本研究通過免疫組化方法檢測(cè)肺腺癌及癌旁組織中的WDR5的表達(dá)，分析WDR5表達(dá)與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，探討WDR5表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2010年1月1日至2014年2月8日于杭州市第三人民醫(yī)院胸外科就診且術(shù)后病理檢查結(jié)果證實(shí)為肺腺癌的患者93例，其中男41例，女52例，年齡 20～84（60.5±10.7）歲，60歲及以上 50 例，60歲以下43例。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

腫瘤分期依據(jù)AJCC第七版臨床分期。癌旁正常組織標(biāo)準(zhǔn)：距腫瘤邊緣＞2 cm，且病理結(jié)果為正常組織。手術(shù)切除肺腺癌組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后送病理科，連續(xù)石蠟切片后行HE染色，所有病理切片均經(jīng)至少2位病理醫(yī)師分別確診。病理分級(jí)根據(jù)UICC 2010年第七版肺癌病理分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人WDR5單克隆抗體購自英國(guó)Abcam公司；EnvisionTM試劑盒以及二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（DAB）顯色試劑盒均購自丹麥DAKO公司；超薄石蠟切片機(jī)以及病理組織烘漂處理儀購自德國(guó)Leica公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：BX41）以及病理大體標(biāo)本成像系統(tǒng)均購自日本OLYMPUS公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 選取所有患者肺腺癌及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織石蠟塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（EnVision法），以抗體稀釋液替代WDR5抗體作為空白對(duì)照，以乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照。

1.4 免疫組化陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 肺腺癌及其癌旁正常組織WDR5染色陽性表現(xiàn)為鏡下腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。首先在100倍光鏡下挑選實(shí)質(zhì)腫瘤區(qū)域，然后在200倍光鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野并拍照。根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強(qiáng)陽性=3。陽性染色細(xì)胞數(shù)分級(jí)為：＜10%（陰性=0），10%～＜30%（弱陽性=1），30%～＜50%（中等陽性=2），≥50%（強(qiáng)陽性=3）。計(jì)算每個(gè)視野的得分之和，取其平均值作為WDR5的相對(duì)表達(dá)水平：≥3時(shí)判定為WDR5相對(duì)高表達(dá)，＜3時(shí)判定為WDR5低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)患者的生存情況作單因素、多因素分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較WDR5高表達(dá)與低表達(dá)患者1、3及5年生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中WDR5的表達(dá)水平比較 53例（57.0%）患者肺腺癌組織中WDR5相對(duì)高表達(dá)，40例（43.0%）WDR5相對(duì)低表達(dá)；30例（32.3%）癌旁正常組織中WDR5相對(duì)高表達(dá)，63例（67.7%）WDR5相對(duì)低表達(dá)，與癌組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1（插頁）。此外，WDR5相對(duì)高表達(dá)的30例癌旁正常組織相對(duì)應(yīng)的癌組織全部呈WDR5相對(duì)高表達(dá)。

圖1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中WD重復(fù)域蛋白5（WDR5）的表達(dá)情況（a：癌旁正常組織WDR5相對(duì)低表達(dá)，×200；b：肺腺癌組織WDR5相對(duì)低表達(dá)，×200；c：肺腺癌組織WDR5相對(duì)高表達(dá)，×200；免疫組化染色）

2.2 WDR5在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 肺腺癌組織中WDR5的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、T分期、病理分級(jí)均無關(guān)（均P＞0.05）；但與N分期和腫瘤分期均相關(guān)（均P＜0.01）。在WDR5相對(duì)高表達(dá)組（53例）中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性35例、陰性18例，Ⅰ/Ⅱ期43例、Ⅲ/Ⅳ期10例；而WDR5相對(duì)低表達(dá)組（40例）中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性14例、陰性26例，Ⅰ/Ⅱ期19例、Ⅲ/Ⅳ期21例；兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 WDR5在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 肺腺癌預(yù)后影響因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，WDR5表達(dá)、N分期和腫瘤分期均是肺腺癌患者預(yù)后的影響因素（均P＜0.01），見表2。進(jìn)一步多因素分析結(jié)果顯示，WDR5表達(dá)和N分期是肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（均P＜0.01），見表3。

表2 肺腺癌預(yù)后影響因素的單因素分析

表3 肺腺癌預(yù)后影響因素的多因素分析

2.4 肺腺癌組織中WDR5的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 本組患者中有3例生存時(shí)間僅為2個(gè)月，其中1例肺腺癌組織中WDR5相對(duì)高表達(dá)，余2例WDR5相對(duì)低表達(dá)。53例WDR5相對(duì)高表達(dá)患者的平均1年生存率為86.8%，3年生存率為41.5%，5年生存率為9.4%；40例WDR5相對(duì)低表達(dá)患者的平均1年生存率為95.0%，3年生存率為80.0%，5年生存率為55.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。上述結(jié)果提示W(wǎng)DR5的表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后相關(guān)。

圖2 肺腺癌組織中WD重復(fù)域蛋白5（WDR5）高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤前列[12]，其中肺腺癌約占所有肺癌的40%[13]。盡管新的治療手段及藥物在不斷的提出并應(yīng)用，但肺癌的死亡率仍然沒有明顯改善[1]。大部分肺癌患者診斷時(shí)就已經(jīng)處于中晚期[14]，其中NSCLC初次確診患者中ⅢA期占16%，ⅢB期占 8%，Ⅳ期患者占 41%[2，15]。因此，探索肺癌進(jìn)展的分子機(jī)制，對(duì)改善肺癌預(yù)后至關(guān)重要。

WDR5是人組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（mixed lineage leukaemia,MLL）1～4組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心亞基[16]，在惡性腫瘤中扮演了重要角色。在促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展方面，WDR5可以將MLL募集到增強(qiáng)子上并調(diào)節(jié)其活性，導(dǎo)致白血病基因和白血病的激活[17]。WDR5通過維持腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制，促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的細(xì)胞增殖以及腫瘤發(fā)展[18]。WDR5在人類前列腺癌組織中過度表達(dá)，其不僅誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的增殖，并且能驅(qū)動(dòng)前列腺癌細(xì)胞發(fā)展出去勢(shì)抗性[19]。在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移方面，WDR5可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞表皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換現(xiàn)象的發(fā)生[7]。另外，WDR5可以上調(diào)淋巴管生成因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致膀胱癌組織內(nèi)淋巴管生成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20]。然而，WDR5基因在肺癌內(nèi)的研究正處于初始階段，這將是肺癌基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要方向。

本研究主要涉及的是WDR5基因在肺腺癌內(nèi)的表達(dá)特征以及其與肺癌臨床病例特征和預(yù)后間的相關(guān)性研究，這是研究WDR5基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中作用的初步探索。本研究顯示，WDR5在肺腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常肺組織。WDR5高表達(dá)與更高的N分期、腫瘤分期相關(guān)。但WDR5的表達(dá)與性別、年齡、T分期、病理分級(jí)和腫瘤直徑無相關(guān)性。提示W(wǎng)DR5在肺腺癌中扮演了促癌基因的角色，其通過促進(jìn)肺腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來促進(jìn)肺腺癌的生物學(xué)進(jìn)展。此外，Cox單因素和多因素分析結(jié)果均表明WDR5高表達(dá)與更差的預(yù)后相關(guān)，提示W(wǎng)DR5是肺腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，進(jìn)一步研究WDR5如何促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展意義巨大。生存分析的結(jié)果同樣表明，相較于低表達(dá)WDR5基因的肺腺癌患者來說，WDR5基因表達(dá)較高的患者通常擁有更差的預(yù)后。

綜上所述，WDR5在肺腺癌中的表達(dá)明顯升高，并與淋巴轉(zhuǎn)移及更差的預(yù)后相關(guān)，提示W(wǎng)DR5基因可能通過促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移來參與腫瘤進(jìn)展，是肺腺癌可靠的預(yù)后指標(biāo)以及潛在的治療靶點(diǎn)。