趨化因子受體表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究

呂楊波 邱丹 陳震宏

近年來(lái)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。2018年全球新發(fā)惡性腫瘤約1 810萬(wàn)例，其中CRC超過(guò)180萬(wàn)例，總發(fā)病率為9.2%[2]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CRC最常見(jiàn)的侵襲方式，是影響預(yù)后的重要因素[3]。數(shù)據(jù)顯示，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（Ⅰ～Ⅱ期）術(shù)后5年生存率達(dá)80%以上，而伴發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（Ⅲ期）術(shù)后5年生存率僅55%左右[3-5]。然而，CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未闡明，且缺乏針對(duì)性藥物。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是指侵襲性強(qiáng)的癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫離并入侵周?chē)|(zhì)，穿過(guò)淋巴管壁，回流至區(qū)域淋巴結(jié)的邊緣竇，形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的過(guò)程[6-7]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)分子標(biāo)志物如趨化因子受體（chemokine receptor，CCR）等在惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用[8]。本研究擬通過(guò)評(píng)估這些分子標(biāo)志物在CRC組織中的表達(dá)，篩選出存在差異的標(biāo)志物，比較其在正常淋巴結(jié)與轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的表達(dá)，從而探討CCR等分子標(biāo)志物與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年1月至2019年12月在衢州市人民醫(yī)院行根治手術(shù)的新發(fā)CRC患者100例為研究對(duì)象，所有患者術(shù)前經(jīng)病理活檢確診。其中男62例，女38 例；年齡 34～81（59.3±11.6）歲；腫瘤直徑 2.1～6.2（3.17±1.67）cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性37例，陰性63例；行右半結(jié)腸癌（包括盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸）根治手術(shù)38例，左半結(jié)腸癌（降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸）根治手術(shù)29例，直腸癌根治手術(shù)33例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 CRC組織中相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR法。術(shù)中留取CRC組織，按照Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)提取總RNA。取1 μg RNA，使用Maxima First Strand cDNA Synthesis試劑盒（美國(guó)Fermentas公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用NCBI primer blast設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度100～200 bp，退火溫度57～60℃，引物序列見(jiàn)表1。在ABI 7500熒光定量PCR儀上，使用2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix試劑盒（美國(guó) Fermentas公司）進(jìn)行 RT-qPCR。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 淋巴結(jié)中相關(guān)分子標(biāo)志物蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光法。由病理科醫(yī)生在手術(shù)切除組織標(biāo)本中取所有肉眼可見(jiàn)或可觸及淋巴結(jié)（主要包括腸旁淋巴結(jié)、中間組淋巴結(jié)、中央組淋巴結(jié)），3.7%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，經(jīng)病理確診是否為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)后，采用Envision法進(jìn)行多色免疫熒光標(biāo)記，并在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，藍(lán)色熒光為DAPI染色細(xì)胞核；紅色熒光標(biāo)記CCR2表達(dá)，綠色熒光標(biāo)記CCR4表達(dá)。熒光強(qiáng)度分為6級(jí)：高倍鏡下不見(jiàn)熒光為（-）；高倍鏡下隱約可見(jiàn)熒光為（+/-）；高倍鏡下可見(jiàn)熒光，低倍鏡下隱約可見(jiàn)為（+）；低倍鏡下可見(jiàn)熒光，高倍鏡下清晰可見(jiàn)為（++）；高倍鏡下熒光耀眼，低倍鏡下清晰可見(jiàn)為（+++）；低倍鏡下熒光耀眼，高倍鏡下刺眼為（++++）。（-）為無(wú)表達(dá)，（+/-）、（+）為低表達(dá)，（++）及以上為高表達(dá)。所用抗體全部購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與陰性患者CRC組織中相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者CRC組織中CCR2、CCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與陰性患者CRC組織中CCR7、TGF-βR1、p53、CD3e、CD8a、IL-2RA mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與陰性患者CRC組織中相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=100）

2.2 CRC患者正常淋巴結(jié)與轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中CCR2、CCR4蛋白表達(dá)比較 正常淋巴結(jié)中CCR2呈低表達(dá)，甚至無(wú)表達(dá)，見(jiàn)圖1a（插頁(yè)）；但在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中表達(dá)顯著增強(qiáng)，見(jiàn)圖1b（插頁(yè)）。正常淋巴結(jié)中CCR4呈低表達(dá)，見(jiàn)圖1c（插頁(yè)）；但在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中呈高表達(dá)，見(jiàn)圖1d（插頁(yè)）。

圖1 CRC患者正常淋巴結(jié)與轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)CCR2以及CCR4蛋白表達(dá)比較（CRC為結(jié)直腸癌；CCR為趨化因子受體；a、c：正常淋巴結(jié)；b、d：轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)；×20）

3 討論

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)是癌組織中發(fā)生腫瘤免疫應(yīng)答事件的標(biāo)志，也是許多癌癥（如早期胃癌、黑色素瘤和直腸癌）中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子[9-10]。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞增多，特別是T細(xì)胞增多，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)有關(guān)[9]。高頻率CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯減少[11]。因此，本研究對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系作一探討。

IL-2又稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由活化的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，是所有T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)因子。IL-2RA通常從細(xì)胞表面裂解，以可溶性受體（sIL-2R）的形式釋放，該受體可以抑制IL-2的活性并起到免疫抑制的作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)血清中IL-2RA水平與多種腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。但本研究結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者CRC組織中CCR7、TGF-βR1、p53、CD3e、CD8a、IL-2RA mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CCR是一類(lèi)具有誘導(dǎo)白細(xì)胞定向遷移或侵襲的小分子蛋白，與腫瘤的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[13]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）/CCL2是CC類(lèi)趨化因子家族成員之一，主要結(jié)合CCR2并通過(guò)CCR2-CCL2軸趨化CCR2陽(yáng)性的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[14]。研究表明，CCR2-CCL2軸與惡性腫瘤的血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，CCR2-CCL2軸直接參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17-18]。CCR4是調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的重要CCR，被認(rèn)為與血液系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)[19]。研究表明，CCR4表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移等有關(guān)[20-21]。CCR4及其配體介導(dǎo)途徑CCR4-CCL2軸被認(rèn)為是除CCR2-CCL2軸外、與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的另一條重要途徑[15，20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者CRC組織中CCR2、CCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者；且CCR2、CCR4在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中呈高表達(dá)。提示CCR2、CCR4可能是腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞入侵淋巴結(jié)的重要驅(qū)動(dòng)因子，其確切分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，CCR2、CCR4表達(dá)與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。