血栓靶向相變納米粒穿透深度與其溶栓效果相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

鐘毅欣 葉曼 徐杰 張文麗 胡柳 方霓 郭大靜

動(dòng)脈血栓性疾病具有較高的致死率和致殘率［1］，阿替普酶作為美國食品藥品管理局唯一批準(zhǔn)的溶栓藥物，其臨床應(yīng)用具有一定優(yōu)勢，但由于其較窄的時(shí)間窗和未知的副作用，廣泛應(yīng)用受到限制［2］。以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的分子影像學(xué)因其制備簡單、多用途的整合功能備受關(guān)注，有望突破這一瓶頸［3］。本課題組前期已成功構(gòu)建靶向血栓相變型納米粒，低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）致全氟己烷（PFH）相變?nèi)芩?，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均取得了良好效果［4-5］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，建立動(dòng)脈血栓的體外模型，進(jìn)一步分析納米粒穿透血栓深度與溶栓效果的相關(guān)性，探討聲致相變的納米粒在動(dòng)脈血栓中的應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性新西蘭大白兔5只，體質(zhì)量4.5～5.0 kg，平均（4.75±0.25）kg，均購于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。雌性SD大鼠10只，10～12周齡，體質(zhì)量280～320 g，平均（290.00±12.80）g，均于SPF級動(dòng)物喂養(yǎng)中心進(jìn)行飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.主要試劑：聚乳酸羥基乙酸（PLGA，分子量8000，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；PFH（北京百靈威科技有限公司）；CREKA多肽、人纖維蛋白原（江蘇強(qiáng)耀生物科技有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、2-嗎啉乙磺酸（MES）、聚乙烯醇（美國Sigma-Aldrich公司）；異丙醇、二氯甲烷（成都科龍公司）；Di I染色劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；OCT包埋劑（日本櫻花公司）；PBS溶液（武漢賽維爾公司）；戊巴比妥鈉（吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院自制）。

2.主要儀器：超聲波破碎儀（美國Sonics公司）；共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）；LIFU治療儀（重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司）；馬爾文粒徑儀（Zetasizer Nano ZS90，英國馬爾文儀器有限公司）；透射電子顯微鏡（H 7500，日本日立公司），流式細(xì)胞儀（FACS Vantage，美國Becton Dickinson公司）；倒置熒光顯微鏡（CKX41，日本奧林巴斯公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.制備靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒：通過改良的W/O/W雙乳化揮發(fā)方法制備相變型納米粒。取50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷，加入200μl的PFH溶液作為內(nèi)水相，冰浴下超聲波破碎儀工作1 min，功率30 W；加入4%聚乙烯醇溶液5 ml作為外水相，繼續(xù)聲振1 min，功率30 W；然后加入10 ml濃度2%的異丙醇溶液，冰浴下攪拌3 h，使PLGA-PFH納米粒表面固化。根據(jù)碳二亞胺法將制得的PLGAPFH納米粒離心洗滌后，用0.1 M的MES（pH值5.2）溶液重懸，EDC和NHS按照摩爾比2∶1加入，冰浴條件下孵育3 h。去除未反應(yīng)的EDC、NHS，加入0.1 M的MES（pH值8.0）重懸后加入5 mg CREKA多肽，冰浴條件下孵育12 h，即制得PLGA-PFH-CREKA納米粒，置于4℃冰箱中備用。

2.靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒的理化特性：以1 ml的注射器將樣品滴于銅網(wǎng)上，待完全干透后置于透射電鏡下觀察其結(jié)構(gòu)；馬爾文粒徑儀測量納米粒大小及表面Zeta電位；流式細(xì)胞儀半定量分析納米粒與CREKA多肽的連接率。將其置于特定的凝膠模具中，使用LIFU（1 W/cm2）輻照15 min，于光鏡下觀察輻照前后納米粒的形態(tài)變化。

3.靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對體外血栓深度的穿透性：采血針穿刺入新西蘭大白兔耳緣動(dòng)脈，10 ml負(fù)壓采血管收集血液，置于37℃的水浴鍋4 h，將血塊切成小塊（大小1.0 cm×0.3 cm×0.3 cm，重約300 mg），PBS溶液清洗3次。PLGA-PFH-CREKA納米粒用DiI染色劑標(biāo)記，將血凝塊置于自制的凝膠模具中，加入PLGA-PFH-CREKA納米粒為兔靶向PT組，不加CREKA多肽的納米粒為兔非靶向PT組，以相同容量的雙蒸水替代PFH為非相變組（NPT組）。將制得的納米粒按照2 mg/ml的濃度配置成25 ml，LIFU（1 W/cm2）輻照2 h，焦距28 mm，然后用濾紙吸去血凝塊表面的水分，記錄其質(zhì)量，計(jì)算溶栓率，公式為溶栓率=（溶栓前質(zhì)量-溶栓后質(zhì)量）/溶栓前質(zhì)量×100%。血凝塊以O(shè)CT包埋，制作冰凍切片，厚度50μm，置于共聚焦顯微鏡下觀察血栓穿透深度（即血栓邊緣到熒光消失的距離）。

4.靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對體內(nèi)血栓的靶向性：以1%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，建立腹主動(dòng)脈附壁血栓模型，將Alexa 488標(biāo)記的人纖維蛋白原（10 mg/kg）注入尾靜脈，備皮后打開腹腔，止血鉗游離腹主動(dòng)脈，10%氯化鐵溶液浸濕濾紙，包裹其外周1圈，4 min后取出濾紙，并用生理鹽水清洗。SD大鼠隨機(jī)分為兩組，分別注射1 mg/ml濃度的DiI染色劑標(biāo)記的靶向納米粒（大鼠靶向PT組）和非靶向納米粒（大鼠非靶向PT組）。待血液循環(huán)3 h后處死動(dòng)物，取出該段腹主動(dòng)脈，生理鹽水清洗2次，OCT包埋，制作冰凍切片后倒置于熒光顯微鏡下觀察納米粒的體內(nèi)靶向性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析；兩組比較行Post-hoc事后檢驗(yàn)。應(yīng)用線性回歸分析溶栓率與血栓穿透深度間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、PLGA-PFH-CREKA納米粒的理化特性

制備的PLGA-PFH-CREKA納米粒平均粒徑為（297.8±11.82）nm，表面平均電位為（1.44±0.22）mV，多分散系數(shù)為0.067±0.038。透射電鏡顯示納米粒為均勻球體，分散性好（圖1A）。流式細(xì)胞儀檢查示在隨機(jī)計(jì)數(shù)的10000個(gè)納米粒中，有9534個(gè)納米粒波長發(fā)生了改變，即95.34%的納米粒與CREKA多肽成功連接。LIFU輻照前后可見納米粒明顯膨脹（圖1B、C）。

圖1 靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒的理化特性

二、靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對體外血栓深度的穿透性

LIFU輻照2 h后，各組對體外血栓深度的穿透性見圖2。共聚焦顯微鏡顯示兔靶向PT組血栓深處可見熒光；兔非靶向PT組血凝塊邊緣熒光強(qiáng)度較弱，其深部未見明顯熒光分布；NPT組血凝塊邊緣可見熒光分布，但血凝塊深部未見明顯熒光信號。兔靶向PT組、兔非靶向PT組、NPT組對血栓的穿透深度分別為（293.01±24.61）μm、（114.52±23.85）μm、（116.78±28.06）μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.187，P<0.001）；兔靶向PT組與兔非靶向PT組和NPT組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001），NPT組與兔非靶向PT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兔靶向PT組、兔非靶向PT組及NPT組靶向溶栓率分別為（60.67±4.37）%、（45.83±6.88）%、（18.67±1.78）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=108.508，P<0.001）；組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。

圖2 各組血栓切片的激光共聚焦三維重建圖（×200）

三、相關(guān)性分析

線性回歸分析顯示，兔靶向PT組的溶栓率與血栓穿透深度之間存在線性相關(guān)（R2=0.818，P<0.05）；兔非靶向PT組、NPT組的溶栓率與血栓穿透深度之間無明顯相關(guān)（R2=0.005、0.021）。

四、靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒的體內(nèi)靶向性

大鼠靶向PT組中，DiI染色劑標(biāo)記的納米粒呈紅色，其與Alexa 488標(biāo)記的纖維蛋白分布大部分一致。大鼠非靶向PT組中，DiI染色劑標(biāo)記的納米粒紅色熒光較少，在通道合并圖片中未與纖維蛋白明顯重合（圖3）。

圖3 大鼠靶向PT組與大鼠非靶向PT組體內(nèi)熒光圖（×100）

討論

早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療對于動(dòng)脈血栓形成患者的遠(yuǎn)期康復(fù)至關(guān)重要。目前的治療方式主要使用靜脈給藥或通過介入手術(shù)的方式直接動(dòng)脈給藥，但由于阿替普酶在血液循環(huán)中不受限制，會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)癥狀性顱內(nèi)出血、缺血再灌注損傷及神經(jīng)中樞中毒等癥狀。因此，臨床亟需探尋一種效益高、劑量可控的方式。通過雙乳化法制備的PLGA-PFH-CREKA納米粒由于其良好的生物相容性，已在納米給藥系統(tǒng)中引起廣泛關(guān)注，相較于單乳化法，雙乳化法可提高親水性材料的包封率［6］。同時(shí)，分子量8000的PLGA聚合鏈短，降解速度更快，可保證納米粒的安全性，這一點(diǎn)在前期研究［4-5，7］中也得到證實(shí)，故本實(shí)驗(yàn)采用雙乳化法制備靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒。

除外制備方式，粒徑大小作為血管內(nèi)給藥的一項(xiàng)關(guān)鍵參數(shù)也值得注意。研究［8］顯示，粒徑<10 nm的粒子通常經(jīng)腎臟濾過和組織外滲而排出，>20 nm的粒子通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)在血液循環(huán)中清除，而粒徑為300 nm的粒子適用于血管內(nèi)給藥，且血管內(nèi)給藥的有效性具有獨(dú)特優(yōu)勢，因此，本實(shí)驗(yàn)制備的PLGA-PFH-CREKA納米粒大小均勻，分散性較好，粒徑在300 nm左右，適用于血管內(nèi)血栓的研究。與前期研究［5］相比，本實(shí)驗(yàn)未加入氧化鐵納米粒，原因在于相變型納米粒的溶栓主要與PFH和超聲的聯(lián)合作用有關(guān)，氧化鐵的目的在于顯像，但從顯像的角度出發(fā)，需要研發(fā)一種效果更佳、更靈敏的集診療一體化的納米粒，故本實(shí)驗(yàn)未加入除PFH的其他顯像劑。

液態(tài)氟碳是含氟脂肪族化合物的一種，近年來主要用于超聲和MRI顯像，其特殊的液氣相變過程為腫瘤治療帶來了新方法［9］。前期研究［5］選擇攜PFH及氧化鐵的相變型納米粒進(jìn)行溶栓實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LIFU的聲功率密度僅需1 W/cm2即可將該納米粒激活，使其從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)，達(dá)到破壞血栓的目的。為進(jìn)一步驗(yàn)證在1 W/cm2LIFU的輻照下相變型納米粒穿透血栓的深度對溶栓效果的影響，本實(shí)驗(yàn)制備了未攜帶氧化鐵的PLGA-PFH-CREKA納米粒，其在溶栓方面也展現(xiàn)出一定優(yōu)勢，經(jīng)LIFU輻照2 h后，兔靶向PT組的血栓穿透深度為（293.01±24.61）μm，而兔非靶向PT組和NPT組 的 血 栓 穿 透 深 度 分 別 為（114.52±23.85）μm、（116.78±28.06）μm，推測在LIFU的作用下，通過超聲的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等物理作用可以使血栓疏松，有助于納米粒滲透，與腫瘤的相關(guān)研究［10］結(jié)論類似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔靶向PT組的溶栓率與血栓穿透深度呈正相關(guān)（R2=0.818，P<0.05），證實(shí)靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對血栓的穿透深度在一定程度上可影響治療效果，值得今后進(jìn)一步探究。

在血栓形成過程中，纖維蛋白有重要作用，與抗體相比，本實(shí)驗(yàn)采用靶向纖維蛋白的多肽，血液清除率和穿透纖維蛋白網(wǎng)的能力均更佳，可進(jìn)一步提高目標(biāo)背景比［11］。體內(nèi)靶向性實(shí)驗(yàn)顯示大鼠靶向PT組中DiI染色劑標(biāo)記的納米粒呈紅色，其與Alexa 488標(biāo)記的纖維蛋白分布大部分一致，進(jìn)一步證實(shí)攜CREKA多肽的納米粒較未攜帶的納米粒在血栓區(qū)域的滯留更多，說明攜CREKA多肽的納米粒具有良好的靶向性。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔靶向PT組與兔非靶向PT組溶栓率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），說明攜帶靶向纖維蛋白的CREKA多肽可放大PLGA-PFH-CREKA納米粒的溶栓效果。但受LIFU探頭輻照面積和深度衰減的影響，相變型納米粒的溶栓效果還需進(jìn)一步提高，今后可通過改進(jìn)LIFU設(shè)備、相變型納米粒的響應(yīng)機(jī)制及對血栓穿透的機(jī)制進(jìn)行解決，這也是未來研究的方向。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒，對血栓纖維蛋白有良好的靶向性，且與血栓穿透深度相關(guān)。這種以相變型納米粒作為溶栓介質(zhì)的方法，有望通過其機(jī)械作用及擴(kuò)大溶栓治療的時(shí)間窗為臨床治療方式的研究帶來新思路。