隴南野生中華獼猴桃實(shí)生苗初代培養(yǎng)體系的建立

陳 強(qiáng) 田鳳鳴 王永斌 劉 瓊 張曉娜

（1 隴南師范高等專科學(xué)校 甘肅 隴南 742500；2 隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心 甘肅 隴南 742500）

獼猴桃是近100 多年來由野生到人工商業(yè)化栽培最為成功的果樹種類之一，目前商業(yè)化栽培的獼猴桃類型主要為中華獼猴桃原變種。種質(zhì)資源是維持產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的源頭，也是物種多樣性的載體。地處甘肅省隴南市獨(dú)特的氣候環(huán)境中的野生中華獼猴桃種質(zhì)資源保存、組織培養(yǎng)及應(yīng)用的相關(guān)研究報(bào)道較少，政府也對(duì)當(dāng)?shù)氐墨J猴桃產(chǎn)業(yè)缺乏重視。就野生獼猴桃的繁殖能力來看，一直存在一些難題。一方面，傳統(tǒng)實(shí)生播種方式繁殖周期長，易造成良種退化[1]，尤其是一些野生瀕危品種，存在種子繁殖能力差的問題[2]；而嫁接繁殖方式存在傷口易感潰瘍病[3]、扦插繁殖過程中生根困難、成活率低等問題[4]。另一方面，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)繁也存在問題，如獼猴桃外植體莖段、葉片、芽等均被有絨毛，消毒難以做到徹底，培養(yǎng)體系建立工作任務(wù)繁重。因此，開展獼猴桃種質(zhì)資源的收集和保存，以及適合的組織快速繁殖方法，是搶救野生瀕危種質(zhì)資源的重要舉措。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。野生中華獼猴桃果實(shí)，采自隴南市文縣碧口鎮(zhèn)，采集完熟的果實(shí)，并剝離出種子，用自來水沖洗干凈后，放培養(yǎng)皿中自然陰干。最后放入紙袋中4 ℃保存?zhèn)溆?；MS 培養(yǎng)基購置于杭州木木生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生獼猴桃種子無菌萌發(fā)前期處理方法。將干燥的種子放于-20 ℃冰箱中保存24 h，并做好標(biāo)記，將冷凍過的種子在室溫(0～15 ℃)下處理24 h。之后轉(zhuǎn)移至燒杯，加蒸餾水100 ml，在50 ℃溫水浴中浸泡30 min，然后倒掉蒸餾水及漂浮在水面上的種子。用3 個(gè)濃度梯度的赤霉素GA3處理(3.5 mmol/L、35 mmol/L、350 mmol/L)，蒸餾水為對(duì)照，室溫條件下浸泡48 h。倒掉上述溶液，用蒸餾水沖洗4～5 次，轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)，加入2%次氯酸鈉消毒10 min，倒掉消毒液，無菌蒸餾水清洗2 次，換加0.1%升汞消毒8 min[5]，倒掉消毒液，無菌蒸餾水清洗5 次。將種子接入培養(yǎng)皿的雙層濾紙上，封口膜包好，放入培養(yǎng)室(溫度25 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度50%)，暗光條件下培養(yǎng)并觀察，期間第10d 在超凈工作臺(tái)補(bǔ)加1 次無菌蒸餾水。

1.2.2 無菌野生獼猴桃實(shí)生苗初代培養(yǎng)基的篩選。將獼猴桃無菌實(shí)生苗剪取根以上部分1.5 cm 左右，接到4 種不同的培養(yǎng)基A(1/2MS 培養(yǎng)基)、B(1/2 MS +1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA)、C(MS 基本培養(yǎng)基)及D(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA)[6]中，在溫度25 ℃±2 ℃、相對(duì)濕度50%的條件下，光照12 h(光照強(qiáng)度2 000 lx)，黑暗12 h。每一種培養(yǎng)基接種9管，每管接1 個(gè)外植體，觀察和記錄生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子無菌萌發(fā)中赤霉素濃度效果的比較。獼猴桃種子通過處理后，在第20～30 d 期間，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)情況，按照根長大于種子直徑視為發(fā)芽，結(jié)果運(yùn)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析了獼猴桃種子發(fā)芽情況(見表1)，赤霉素(GA3)濃度為35 mmol/L 處理的種子發(fā)芽率高達(dá)22.7%，顯著高于其他3 組。另外與對(duì)照相比，3.5～35 mmol/L GA3處理種子后的發(fā)芽率均有顯著增高，但是當(dāng)GA3濃度達(dá)到350 mmol/L 后種子喪失了發(fā)芽能力。

表1 野生獼猴桃種子最終發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)表

2.2 實(shí)生苗初代培養(yǎng)條件的篩選。將無菌野生獼猴桃實(shí)生苗分別接到4 種不同培養(yǎng)基中，3 周后統(tǒng)計(jì)可見葉片數(shù)，觀察并記錄了生長情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，1/2MS 培養(yǎng)基在無菌實(shí)生苗的培養(yǎng)中，效果顯著低于對(duì)照，加入植物生長調(diào)節(jié)劑在本試驗(yàn)中沒達(dá)到顯著作用(表2)。1/2MS 及MS 基本培養(yǎng)基中生長的無菌苗，有少部分出現(xiàn)蜷曲和玻璃化現(xiàn)象。另外，植物生長調(diào)節(jié)劑的加入，保證了無菌實(shí)生苗葉片正常的生長發(fā)育。

表2 無菌野生獼猴桃實(shí)生苗在不同培養(yǎng)基中的生長情況統(tǒng)計(jì)表

3 結(jié)論與討論

保護(hù)和發(fā)展野生獼猴桃資源，最便捷的保存方式就是種子的保存。然而，獼猴桃種子發(fā)芽十分困難，處理程序復(fù)雜[7]。另外，獼猴桃的葉片、莖段等外植體均被絨毛[8]。在外植體消毒到初代培養(yǎng)體系建立過程中污染率及褐化率較高，成活率只有約一半[9]。試驗(yàn)結(jié)果中對(duì)照組種子的發(fā)芽率為2.12%(表1)，可能與種子前期消毒使用2%次氯酸鈉有關(guān)。次氯酸鈉消毒的效果不穩(wěn)定，用于打破獼猴桃種子休眠更有意義[10]。另外，在獼猴桃實(shí)生苗組培研究中，初代培養(yǎng)最好的選擇為MS 培養(yǎng)基，絕大多數(shù)研究者和我們的研究結(jié)果一致，但在植物生長調(diào)節(jié)劑的使用方面，目前看來有一定的爭論。一方面，據(jù)Pedroso[11]等人報(bào)道，在獼猴桃莖段和莖尖組織培養(yǎng)時(shí)，在不加任何激素的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)材料存活率達(dá)93%，朱道圩[12]等人報(bào)道了用獼猴桃的實(shí)生苗進(jìn)行組織培養(yǎng)同莖段、莖尖一樣，培養(yǎng)基中無需附加任何激素。上述結(jié)論與表2 的結(jié)果相一致，也較好的說明本試驗(yàn)中MS 培養(yǎng)基中組培苗與MS + 1.0 mg/L 6 - BA +0.1 mg/L NAA 培養(yǎng)基中組培苗葉片數(shù)差異不顯著的事實(shí)。