肝藏血中肝郁血滯病機(jī)的實(shí)驗(yàn)探查

錢夢(mèng)， 岳晨， 楊宗純， 朱昊如， 范方馨， 謝鳴

（北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)系，北京 100029）

肝郁血滯是指肝氣郁滯與血行不暢并存的一種病理變化。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣行則血行，氣滯則血滯或血瘀。肝藏血是指肝具有攝血、貯藏血液和調(diào)節(jié)血量的功能[1]。若肝不藏血可導(dǎo)致貯血不足，肝血虧虛，甚或不能制約肝陽(yáng)，肝陽(yáng)上亢，收攝失常引起出血諸證。肝主疏泄是指肝具有疏達(dá)舒發(fā)、調(diào)暢氣機(jī)的功能，與肝藏血的功能密切相關(guān)。肝之疏泄有度，氣機(jī)調(diào)暢，才能有效地儲(chǔ)藏、調(diào)節(jié)、收攝血液；當(dāng)肝疏泄不及，氣機(jī)不暢，則可引起血行不暢，甚則留而成瘀[2]，所謂“氣結(jié)則血凝”（《血證論》）。但目前有關(guān)“肝藏血”內(nèi)涵多側(cè)重于肝疏泄太過或肝陽(yáng)亢旺引起的出血方面[3]，有關(guān)疏泄不及導(dǎo)致的血行不暢的探討較少。從中醫(yī)病機(jī)的角度來看，肝郁與血滯作為不同的病理環(huán)節(jié)，二者在病機(jī)演變中存在相互關(guān)系，特別是肝臟在氣郁血滯證中扮演的角色及其現(xiàn)代病理生理學(xué)內(nèi)涵尚不清楚。目前了解到中醫(yī)血瘀證可能涉及血郁、血滯、血瘀、血結(jié)等不同類型，但血行障礙則是其共同的病理生理特點(diǎn)，血液循環(huán)和微循環(huán)障礙、血液高黏滯狀態(tài)以及血小板活化和黏附聚集性增強(qiáng)是中醫(yī)血瘀證的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[4]?；谥嗅t(yī)氣血相關(guān)及肝主藏血的理論和現(xiàn)代有關(guān)血瘀證內(nèi)涵的認(rèn)識(shí)，本研究擬在前期觀察到的束縛應(yīng)激肝郁大鼠模型伴有血液黏度異常[5]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察該模型復(fù)制過程中血液流變及凝血功能的變化，以探查肝郁證形成及發(fā)展中血液運(yùn)行的功能狀態(tài)，為認(rèn)識(shí)中醫(yī)“肝藏血”及“肝郁血滯”病機(jī)的現(xiàn)代內(nèi)涵提供一定的實(shí)證理解，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量210~220 g，級(jí)別SPF/VAF，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有動(dòng)物提前3 d購(gòu)入，于動(dòng)物房適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：光照節(jié)律12-12 h（6∶00 a.m.—6∶00 p.m.），溫度20~25℃，相對(duì)濕度50%±5%。本次實(shí)驗(yàn)方案獲得了北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：BUCM-4-2018060415-2019）。

1.2 試劑大鼠皮質(zhì)酮（CORT）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190316.60170R）、大鼠5-羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190316.60087R）、大鼠去甲腎上腺素（NE）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190316.60075R）、血漿抗凝蛋白C（PC）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190316.60441R）、游離蛋白S（FPS）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190316.60398R）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190316.60473R），以上試劑盒均由北京瑞格博生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 儀器自制束縛筒為有機(jī)玻璃制成的圓筒狀結(jié)構(gòu)，主筒長(zhǎng)25 cm，筒口外徑7 cm，內(nèi)徑5 cm。前端置有一直徑小于主筒的、可以前后調(diào)節(jié)的帶有透氣孔的、便于大鼠頭伸進(jìn)的有機(jī)玻璃前罩，后端為可調(diào)節(jié)間距的開關(guān)閥門。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱：木質(zhì)，100 cm×100 cm×40 cm，內(nèi)壁為黑色，底部線條為白色，箱底被劃分為25個(gè)全等正方形格子，中心9個(gè)格作為中心區(qū)域，其余周邊格為周圍區(qū)域。敞箱頂部的攝像頭視野覆蓋整個(gè)曠場(chǎng)箱。采用The Observer Video-Pro&Echo Vision 3.0系統(tǒng)分析大鼠的行為。

Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckmancoulter公司）；Thermo Multiskan MK7全自動(dòng)酶標(biāo)儀[Thermo（原芬蘭雷勃）公司]；ACL TOP全自動(dòng)血凝分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；LBY-N6C全自動(dòng)血流變儀（北京普利生公司）。

1.4 造模方法參考文獻(xiàn)[6]采用慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型：將大鼠放入有機(jī)玻璃束縛裝置中，每天束縛3 h（8∶00—11∶00 a.m.），連續(xù)造模28 d。

1.5 分組處理健康雄性Wistar大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組各20只。造模組大鼠按上述方法造模，正常組不予任何處理，2組均常規(guī)飼養(yǎng)。分別于實(shí)驗(yàn)2周末和4周末隨機(jī)挑選正常組與模型組各10只大鼠進(jìn)行糖水與曠場(chǎng)試驗(yàn)，處殺并低溫取下丘腦及收集血液樣本，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)指標(biāo)

1.6.1 .1 一般外觀表征 于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的每周二和周六觀測(cè)并記錄各組大鼠的一般外觀行為（行為狀態(tài)、活躍程度、情緒反應(yīng)、睡眠狀態(tài)）的變化，并給予評(píng)分。外觀行為的各項(xiàng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[7]。統(tǒng)計(jì)每周各組大鼠外觀行為各項(xiàng)積分的變化，取每周2次觀測(cè)的均值。最后，將性質(zhì)相近的外觀表征合并為2個(gè)指標(biāo)群（活動(dòng)狀態(tài)、情緒睡眠），并分別統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)群的積分。

1.6.1 .2 糖水偏嗜試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[8]于造模第2周末和第4周末進(jìn)行糖水試驗(yàn)測(cè)試。具體操作方法：每只動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，分別給予2瓶100 mL的水。第1個(gè)24 h內(nèi)，2瓶水均為1%蔗糖水；第2個(gè)24 h內(nèi)，給予1瓶1%蔗糖水，1瓶蒸餾水；第3個(gè)24 h內(nèi)，動(dòng)物禁食禁水；于第4個(gè)24 h內(nèi)，進(jìn)行糖水/純水偏嗜試驗(yàn)，給予每只大鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶蒸餾水，自由飲水1 h后取出2瓶水，并對(duì)2瓶稱質(zhì)量，記錄大鼠的糖水消耗量與純水消耗量并計(jì)算糖水偏嗜度。糖水偏嗜度=（糖水消耗量/總液體消耗量）100%。

1.6.1 .3 曠場(chǎng)試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9]于實(shí)驗(yàn)的第2周末和第4周末進(jìn)行。將大鼠緩慢放入黑色敞箱底部中央后開始同步錄像，每只大鼠計(jì)時(shí)5 min，記錄大鼠5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，存檔后待分析。實(shí)驗(yàn)保證在室內(nèi)光線柔和、安靜的條件下進(jìn)行，并于每只大鼠測(cè)試結(jié)束后清理尿液和糞便，再進(jìn)行下只大鼠的測(cè)試。

1.6.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) ①下丘腦：NE，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。②血漿：CORT、5-HT、AT-Ⅲ、PC和FPS，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。③全血：血液流變學(xué)，血流變儀檢測(cè)；凝血4項(xiàng)[凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）]，發(fā)色底物法檢測(cè)；血小板聚集率，二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)法檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法釆用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理全部數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差析（one-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)后，采用Student Newman Keuls Test檢驗(yàn)；非正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有圖表均用GraphPad Prism 7軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 造模不同時(shí)間點(diǎn)的中醫(yī)證候外觀表征的變化

2.1.1 體質(zhì)量和一般外觀表征的變化 由表1可見，正常組和模型組大鼠體質(zhì)量由第1~4周均逐漸增加，其中，正常組大鼠的增長(zhǎng)速度高于模型組。與正常組比較，模型組大鼠第1~4周的體質(zhì)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。從表2中可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第1~4周活動(dòng)狀態(tài)積分明顯升高（P<0.01）。從表3中可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第1~4周情緒睡眠積分明顯升高（P<0.01）。

表1 肝郁模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化Table 1 Comparison of the changes of body mass in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，g）

表1 肝郁模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化Table 1 Comparison of the changes of body mass in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，g）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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表2 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)活動(dòng)狀態(tài)積分的變化Table 2 Comparison of the changes of active state in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

表2 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)活動(dòng)狀態(tài)積分的變化Table 2 Comparison of the changes of active state in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

①P<0.01，與正常組比較

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表3 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)情緒睡眠積分的變化Table 3 Comparison of the changes of emotionalsleep scores in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

表3 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)情緒睡眠積分的變化Table 3 Comparison of the changes of emotionalsleep scores in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

①P<0.01，與正常組比較

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2.1.2 糖水實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 各組大鼠糖水實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表4。由表4可見，與正常組比較，模型組大鼠第2周和第4周糖水偏嗜度均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。

表4 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)糖水偏嗜度變化Table 4 Comparison of the changes of sugar water preference in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，%）

表4 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)糖水偏嗜度變化Table 4 Comparison of the changes of sugar water preference in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，%）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表5。由表5可見，與正常組比較，模型組大鼠第2周爬行里程數(shù)明顯增加（P<0.01），中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯降低（P<0.05），第4周爬行里程數(shù)與中央?yún)^(qū)停留時(shí)間均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。

表5 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的自主行為變化Table 5 Comparison of the changes of autonomic behaviors in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

表5 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的自主行為變化Table 5 Comparison of the changes of autonomic behaviors in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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2.2 造模不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化

2.2.1 神經(jīng)-內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)的變化 由表6可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第2周和第4周的血漿5-HT水平均明顯降低（P<0.05或P<0.01），第4周下丘腦NE水平明顯降低（P<0.01），血漿CORT水平明顯升高（P<0.05）。

表6 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化Table 6 Comparison of the changes of laboratory indexes in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

表6 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化Table 6 Comparison of the changes of laboratory indexes in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 血液流變及凝血功能相關(guān)指標(biāo)的變化

2.2.2 .1 血液流變學(xué)的變化 表7結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠第4周全血黏度低切、中切、高切以及血漿黏度均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由表8可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第4周全血黏度低切、中切、高切以及血漿黏度均明顯升高（P<0.01）。

表7 肝郁證模型大鼠第2周血液流變的變化Table 7 Comparison of the hemorheologicalchanges in rats with liver stagnation syndrome in the second week（±s）

表7 肝郁證模型大鼠第2周血液流變的變化Table 7 Comparison of the hemorheologicalchanges in rats with liver stagnation syndrome in the second week（±s）

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表8 肝郁證模型大鼠第4周血液流變的變化Table 8 Comparison of the hemorheological changes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week（±s）

表8 肝郁證模型大鼠第4周血液流變的變化Table 8 Comparison of the hemorheological changes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week（±s）

①P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 .2 凝血4項(xiàng)的變化 由表9、10可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第2周PT、APTT、TT均明顯降低（P<0.01），F(xiàn)IB明顯升高（P<0.05），第4周PT和APTT均明顯降低（P<0.01），F(xiàn)IB明顯升高（P<0.05），TT降低但差異無顯著性意義（P>0.05）。

表9 肝郁證模型大鼠第2周凝血4項(xiàng)的變化Table 9 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the second week （±s）

表9 肝郁證模型大鼠第2周凝血4項(xiàng)的變化Table 9 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the second week （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 .3 血小板聚集率的變化 由表11可以看出，與正常組比較，模型組大鼠實(shí)驗(yàn)第2周的3 min血小板聚集率明顯升高（P<0.01）；第4周的1、3、5 min血小板聚集率均明顯升高（P<0.01）。

表11 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血小板聚集率的變化Table 11 Comparison of the changes of platelet aggregation rate in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

表11 肝郁證模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血小板聚集率的變化Table 11 Comparison of the changes of platelet aggregation rate in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

①P<0.01，與正常組比較

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表10 肝郁證模型大鼠第4周凝血4項(xiàng)的變化Table 10 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week （±s）

表10 肝郁證模型大鼠第4周凝血4項(xiàng)的變化Table 10 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week （±s）

①P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 .4 血漿抗凝輔助因子的變化 由表12可以看出，與正常組比較，模型組大鼠血漿PC、FPS、AT-Ⅲ的表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01）。

表12 肝郁證模型大鼠抗凝輔助因子的變化Table 12 Comparison of the changes of anticoagulation cofactor in rats with liver stagnation syndrome （±s）

表12 肝郁證模型大鼠抗凝輔助因子的變化Table 12 Comparison of the changes of anticoagulation cofactor in rats with liver stagnation syndrome （±s）

①P<0.01，與正常組比較

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3 討論

3.1 肝郁證模型的復(fù)制與評(píng)價(jià)肝郁證動(dòng)物模型復(fù)制方法較多[10-11]，目前學(xué)界多傾向于基于中醫(yī)發(fā)病學(xué)特點(diǎn)采用情志刺激法誘導(dǎo)的相關(guān)模型，如捆綁束縛法[12]、夾尾激怒法[13]和不可預(yù)知慢性刺激法[14]等，模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通常包括中醫(yī)證候外觀表征、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[15-17]等在內(nèi)的多項(xiàng)綜合指標(biāo)體系。

研究發(fā)現(xiàn)，采用孤養(yǎng)聯(lián)合慢性不可預(yù)見性溫和刺激法[18]和孤養(yǎng)聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激法[19]誘導(dǎo)3周的肝郁證模型大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)體毛干枯、活動(dòng)減少、精神萎靡等癥狀，第2周與第3周糖水偏嗜度明顯降低，穿格次數(shù)明顯降低、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯增加，皮質(zhì)及海馬內(nèi)5-HT含量明顯降低，血漿CORT明顯升高；采用慢性束縛應(yīng)激法4周建立的肝郁證模型大鼠的糖水偏嗜度明顯降低，皮質(zhì)內(nèi)5-HT和NE表達(dá)明顯降低，外周血CORT含量顯著增加[20]。表明肝郁證動(dòng)物不僅表現(xiàn)出心情低落，情緒調(diào)節(jié)的障礙，而且伴有中樞與外周5-HT和NE水平的異常和HPA功能的亢進(jìn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用束縛應(yīng)激法誘導(dǎo)的肝郁證模型大鼠在第1~2周出現(xiàn)躁動(dòng)、易激惹等表現(xiàn)，曠場(chǎng)試驗(yàn)中的爬行里程數(shù)明顯增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)至束縛第4周時(shí)則表現(xiàn)出萎靡、少動(dòng)、扎堆、反應(yīng)遲緩等表現(xiàn)；模型大鼠在第2~4周時(shí)糖水消耗率明顯降低，曠場(chǎng)試驗(yàn)中的爬行里程數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間均明顯降低，出現(xiàn)貼邊，探索減少。表明模型大鼠具有階段性發(fā)展，即中樞由興奮逐漸轉(zhuǎn)為抑制的特點(diǎn)。本研究也觀察到，該模型大鼠下丘腦NE、血漿5-HT含量在第2周和第4周均明顯降低，同時(shí)，血漿CORT持續(xù)升高，表明模型大鼠出現(xiàn)交感活性的降低和HPA軸功能亢進(jìn)。故該模型符合中醫(yī)肝郁證外觀表征和神經(jīng)-內(nèi)分泌變化特征[21]。

3.2 肝郁證模型大鼠的血液流變學(xué)狀態(tài)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝主藏血，參與全身血行的調(diào)節(jié)，肝氣郁滯會(huì)影響到肝藏血的功能。既往臨床研究曾觀察到，肝郁證患者血漿還原黏度和血沉方程K值明顯升高[22]，肝郁氣滯型原發(fā)性開角型青光眼患者低、中、高切變率下的全血黏度明顯升高[23]。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：采用夾尾法2 d復(fù)制的肝郁證模型大鼠血小板聚集率、血沉、全血黏度及血漿黏度均明顯增加[24]；采用束縛四肢法2周建立的肝郁模型大鼠不同切變率下的全血黏度和血漿黏度明顯升高[25]。結(jié)果提示，肝郁證存在血液流變學(xué)方面的異常，但有關(guān)中醫(yī)肝藏血內(nèi)涵及肝郁與血滯在病機(jī)上的聯(lián)系尚不清楚。

已知血液流變可直接反映血液流動(dòng)性、凝滯性和血液黏度的變化；凝血4項(xiàng)包括PT、APTT、TT、FIB，是目前臨床用于評(píng)估凝血功能最常見的指標(biāo)[26]。其中，PT與APTT反映血漿中凝血因子水平，是評(píng)估凝血功能的主要指標(biāo)；TT為纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白所需時(shí)長(zhǎng)，反映血漿中有無出血抗凝物和是否存在纖溶現(xiàn)象；FIB是纖維蛋白的前體，反映血中纖維蛋白原的含量，纖維蛋白原可通過凝血酶酶促轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，起到阻塞血管，防止過度出血的作用，其含量高低表明機(jī)體是否處于高凝狀態(tài)[27-28]。血小板聚集試驗(yàn)主要反映血小板的聚集功能，其聚集強(qiáng)度與血液高凝狀態(tài)密切相關(guān)。這些指標(biāo)均在一定程度上反映了機(jī)體血液流行狀態(tài)。為全面地探討肝郁與血行之間的關(guān)系，本研究對(duì)肝郁大鼠模型復(fù)制過程中反映血液流行狀態(tài)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。

結(jié)果觀察到，造模2周時(shí)的大鼠全血黏度和血漿黏度、血小板聚集率與正常組大鼠無顯著區(qū)別，但至第4周時(shí)10/s、60/s、150/s不同切變率下的全血黏度和血漿黏度均顯著升高，1、3、5 min的血小板聚集率均明顯升高，表明慢性束縛中的持續(xù)應(yīng)激可使模型大鼠血液黏度增高。本研究還觀察到，模型大鼠造模第2周和4周時(shí)的PT、APTT、TT均顯著縮短，F(xiàn)IB明顯升高，表明大鼠在模型復(fù)制早期的血凝狀態(tài)即呈增強(qiáng)趨勢(shì)，且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，進(jìn)一步出現(xiàn)血液黏度增高，凝血功能增強(qiáng)，并處于高凝狀態(tài)，此與模型大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝郁外觀表征和神經(jīng)-內(nèi)分泌異常變化的顯現(xiàn)及加重的結(jié)果相一致，提示肝郁發(fā)展中伴隨有血液流變方面的異常變化，此可為中醫(yī)肝郁血滯的病機(jī)聯(lián)系提供一定的現(xiàn)代理解。

3.3 肝郁證模型大鼠血液流變異常的機(jī)制肝臟在維持凝血狀態(tài)的平衡中有著非常重要的作用。肝臟不僅是大部分凝血因子生成分泌的臟器，而且還能夠通過產(chǎn)生AT-Ⅲ和PC等抗凝輔助因子來抑制血液高凝及異常的血栓生成。其中：AT-Ⅲ與激活的凝血因子結(jié)合、水解，從而阻斷凝血級(jí)聯(lián)[29]；PC活化后與FPS結(jié)合，降解凝血因子Va和Ⅷa，防止其活化形成凝血酶，達(dá)到抑制血小板活化的作用。由此可以看出，肝臟通過產(chǎn)生凝血因子和抗凝輔助因子，調(diào)節(jié)凝血/抗凝血的平衡，以維持血液正常流行狀態(tài)。本研究觀察到，束縛4周的大鼠血漿抗凝輔助因子PC、FPS、AT-Ⅲ明顯降低，結(jié)合該模型大鼠出現(xiàn)血液黏度和血小板聚集性增高，血漿PT和APTT縮短及FIB升高等變化，推測(cè)肝臟對(duì)凝血和抗凝輔助因子的生成調(diào)節(jié)可能參與該模型大鼠的血液流變異常的病理發(fā)生，也可能是中醫(yī)學(xué)肝郁與血滯病機(jī)關(guān)聯(lián)的臟腑病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一。

3.4 中醫(yī)肝郁證與現(xiàn)代抑郁癥目前認(rèn)為，中醫(yī)肝郁證與現(xiàn)代抑郁癥二者甚為類近，其在內(nèi)涵上有很多交集[30-33]。臨床研究曾觀察到：中醫(yī)肝郁證患者血漿還原黏度和血沉方程K值明顯升高[22]，全血黏度明顯升高[23]；抑郁癥患者纖維蛋白原[34]、血小板的活化[35]和聚集率[36]均明顯增加，且纖維蛋白原水平和血小板活化程度均與抑郁癥嚴(yán)重程度相關(guān)[34-35]。本研究采用的慢性束縛應(yīng)激法也是抑郁癥動(dòng)物模型復(fù)制的常用方法之一[37]。既往曾有研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激可以增強(qiáng)小鼠血小板激動(dòng)劑凝血酶和ADP刺激血小板聚集的能力[38]。本次研究觀察到，束縛應(yīng)激模型大鼠不僅出現(xiàn)中醫(yī)肝郁證的外部表現(xiàn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的異常，而且伴有血流變障礙及凝血和血小板聚集功能的增強(qiáng)，這與由其他方法復(fù)制的抑郁癥動(dòng)物模型所表現(xiàn)出的神經(jīng)-內(nèi)分泌[39]和血液學(xué)異常[40]具有較多的類同，進(jìn)一步證明中醫(yī)肝郁與西醫(yī)抑郁癥二者在病理生理學(xué)方面具有的同質(zhì)性。提示該法建立的中醫(yī)肝郁模型用于抑郁癥中醫(yī)藥防治及其機(jī)制研究方面具有潛在價(jià)值。

本研究動(dòng)態(tài)觀察了肝郁證模型大鼠造模過程中的中醫(yī)證候和血液流變/凝血狀態(tài)的變化，結(jié)果顯示：束縛過程中大鼠經(jīng)歷由早期的神經(jīng)興奮狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為抑郁狀態(tài)的變化過程，束縛4周不僅表現(xiàn)出少動(dòng)喜靜、行動(dòng)遲緩、情緒低落等抑郁狀態(tài)，而且伴有交感神經(jīng)活性降低和HPA軸的亢進(jìn)等神經(jīng)內(nèi)分泌變化特點(diǎn)。大鼠束縛第2周即出現(xiàn)凝血活性的增強(qiáng)，至第4周進(jìn)一步出現(xiàn)全血黏度和血漿黏度及血小板聚集率的顯著升高，血液呈現(xiàn)出一定程度的高凝狀態(tài)，同時(shí)，血中源于肝臟的凝血因子增強(qiáng)和抗凝輔助因子降低。表明隨著肝郁的形成及發(fā)展，逐漸出現(xiàn)血行方面的障礙，肝臟可能參與了其中的部分調(diào)節(jié)，但其確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為揭示中醫(yī)“肝藏血”及“肝郁血滯”病機(jī)的現(xiàn)代內(nèi)涵提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。