長足大竹象外切葡聚糖酶活性最適反應(yīng)條件的初步探究

唐昊，王昌吉，王明珺，甘曉鳳，張鑫月，羅朝兵

(樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614000)

竹纖維是儲量巨大的可再生資源，利用生物法處理木質(zhì)纖維素并使之能夠進行能源轉(zhuǎn)化是當(dāng)前國際研究熱點之一[1-2].自然界中除微生物降解纖維素外，還存在著超過100種昆蟲依靠自身腸道系統(tǒng)對木質(zhì)纖維素實現(xiàn)高效降解，其中纖維素酶系統(tǒng)在其中發(fā)揮著重要作用[3-4].

昆蟲是種類繁多的生物種群，研究發(fā)現(xiàn)具有天然生物質(zhì)利用系統(tǒng)(natural biomass utilization systems，NBUS)的植食性昆蟲是開發(fā)工業(yè)纖維素分解酶的潛在資源[5].外切葡聚糖酶是植食性昆蟲消化道纖維素酶系中重要組分，降解過程中使得纖維素分子結(jié)構(gòu)變得疏松而有利于其它纖維素酶進入纖維素內(nèi)部，從而加速纖維素降解[6]，然而外切葡聚糖酶對纖維二糖的耐受性差且酶活較低，因而迫使需要挖掘新的酶資源.寧娜等[7]對臺灣乳白蟻和黃翅大白蟻消化道中纖維素降解外切葡聚糖酶活性比較后發(fā)現(xiàn)，黃翅大白蟻外切葡聚糖酶集中于中腸，而臺灣乳白蟻主要集中于后腸；Wang等[8]發(fā)現(xiàn)福壽螺(Ampullariacrossean)外切葡聚糖酶對高濃度纖維二糖具有耐受性；佟新新[9]研究纖維素酶解蔗渣工藝中發(fā)現(xiàn)黑曲霉外切葡聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性；趙宣等[10]克隆了草酸青霉外切葡聚糖酶基因并在畢赤酵母中成功表達(dá).這些研究結(jié)果表明，不同的昆蟲的腸道分段中，外切葡聚糖酶活性具有較大的差異，同時具有潛在的利用價值并可應(yīng)用于纖維素的利用.

長足大竹象(Cyrtotrachelusbuqueti)是慈竹、青皮竹和大葉慈等叢生竹類植物的重要害蟲，危害竹材生長，嚴(yán)重阻礙了竹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11].已有研究表明，長足大竹象消化道內(nèi)具有較高的纖維素酶活，同時其發(fā)育轉(zhuǎn)錄組表明其幼蟲和成蟲階段，存在大量的碳水化合物活性酶(CAZy)基因表達(dá)[12].目前，長足大竹象消化道纖維素酶中內(nèi)切葡聚糖酶酶活性質(zhì)已探明[13]，但外切葡聚糖酶反應(yīng)條件尚不清楚.因此，本研究設(shè)計單因素試驗和正交優(yōu)化試驗探究長足大竹象外切葡聚糖酶的最適反應(yīng)條件，為長足大竹象外切葡聚糖酶的挖掘提供借鑒并為竹木質(zhì)纖維素的能源轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)提供新的酶資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲樣本的收集及粗酶液的制備 樣本長足大竹象采集于四川省沐川縣(E 103°90′，N 28°97′).樣本處理流程如下：分別取40只雌蟲、雄蟲及幼蟲饑餓24 h后，在無菌室超凈工作臺里解剖出消化道放置于無菌水及生理鹽水中清洗4～5次，低溫?zé)o菌研缽器皿中研磨至勻漿，離心10 min后收集上清液(4 ℃、4球000 r/min)，經(jīng)0.22 μm的濾膜處理后作為粗酶液.所有試驗生物學(xué)重復(fù)5次.

1.1.2 試劑與儀器 微晶纖維素(MCC)，3，5-二硝基水楊酸(DNS)，葡萄糖(D-(+)-glucose)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(BSA)，檸檬酸緩沖液(pH 5.6)，考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue-250)；酶標(biāo)儀，高速冷凍離心機，恒溫混勻儀，pH儀.

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 采用Bradford法確定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[14].取7只試管分別加入0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mL 1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，檸檬酸緩沖液(pH 5.6、0.1 mol/L)定容到0.1 mL，加入3 mL的Brilliant Blue G-250，595.0 nm處所測定吸光值作為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)的濃度標(biāo)準(zhǔn)作為橫向的坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線.

DNS法確定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[15].取8支試管分別加入0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)和0.02 g微晶纖維素底物，蒸餾水定容至1 mL，加入1.5 mL DNS顯色劑加熱5 min后冷卻至室溫，540 nm波長處測得各個濃度的吸光值作為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.2 長足大竹象外切葡聚糖酶活性測定方法 外切葡聚糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸(DNS法)顯色法測定[15].以微晶纖維素作為反應(yīng)底物，0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液為溶劑，分別取50 μL酶液和950 μL底物充分混勻，恒溫37 ℃水浴反應(yīng)15 min后加入1.5 mL的DNS終止反應(yīng)，沸水加熱5 min后定容至20 mL，使用酶標(biāo)儀測定吸光值(λ=540 nm).對照組酶液進行滅活處理，步驟與上述步驟相同，每組試驗進行5次重復(fù).

外切葡聚糖酶活力單位的定義：底物在相應(yīng)溫度下反應(yīng)每分鐘酶解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶量.酶活力及酶比活力的計算公式如下：

式中：Gc：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中葡萄糖相應(yīng)的濃度，mg/mL；V：反應(yīng)體系總體積，為20 mL；M：葡萄糖相對分子質(zhì)量，180；t：反應(yīng)時間；Ec：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中蛋白質(zhì)相應(yīng)的濃度：mg/mL.

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 選取pH、底物濃度和反應(yīng)溫度作為單因素條件探究每種因素的最適反應(yīng)條件(表1)，確定長足大竹象外切葡聚糖酶的最佳理論反應(yīng)條件.

表1 單因素試驗設(shè)計

1.2.4 正交試驗設(shè)計 為進一步優(yōu)化外切葡聚糖酶pH、底物濃度和反應(yīng)溫度最適反應(yīng)條件，本試驗設(shè)計了正交試驗(表2).

表2 正交試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過Bradford法確定了蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=3.785x-0.002 8(R2=0.996 8).同時，由DNS法確定了葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=0.977 9x-0.025 2(R2=0.992 4).

2.2 單因素試驗確定長足大竹象外切葡聚糖酶的最適反應(yīng)條件

2.2.1 長足大竹象外切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度 根據(jù)表1的試驗設(shè)計，以溫度為橫坐標(biāo)，長足大竹象外切纖維素酶比活力為縱坐標(biāo)比較了不同反應(yīng)溫度下長足大竹象雌蟲、雄蟲及幼蟲外切葡聚糖酶的活性.由圖1可知，長足大竹象外切葡聚糖酶比活力隨著溫度的上升均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，雌蟲在30 ℃出現(xiàn)最大值，雄蟲在30～40 ℃之間出現(xiàn)最大值，而對于幼蟲而言，其在40 ℃出現(xiàn)最大值，由此可推斷長足大竹象外切葡聚糖酶活性最適反應(yīng)溫度介于30～40 ℃之間.

小寫字母的不同表示差異顯著(P<0.05).Different letters represent the significant differences(P<0.05).

2.2.2 長足大竹象外切葡聚糖酶的最適底物濃度 對于長足大竹象成蟲，外切葡聚糖酶比活力隨著底物濃度的升高逐漸上升，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時，酶比活力達(dá)到最大值；而幼蟲在底物濃度為0.5%時比活力達(dá)到最大值，隨著底物濃度的升高，外切葡聚糖比活力有下降的趨勢(圖2).以上結(jié)果表明長足大竹象成蟲的外切葡聚糖的表現(xiàn)出最大酶活力時，最適底物濃度為2%，而幼蟲的為0.5%.

*小寫字母的不同表示差異顯著(P<0.05).Different letters represent the significant differences(P<0.05).

2.2.3 長足大竹象外切葡聚糖酶的最適pH條件 由圖3可知，長足大竹象外切葡聚糖酶活性隨著酶反應(yīng)pH的上升，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢.其中長足大竹象成蟲(雌)的外切葡聚糖酶的最大比活力出現(xiàn)在pH 4.8處，成蟲(雄)的外切葡聚糖酶的最大比活力出現(xiàn)在pH 4.8～5.2的范圍內(nèi)且在pH 4.8和pH 5.2之間酶比活力未表現(xiàn)出顯著的差異；而幼蟲的酶比活力在pH 4.4～5.6出現(xiàn)最大值，在該pH區(qū)間內(nèi)，酶比活力也未表現(xiàn)出顯著的差異.以上結(jié)果說明成蟲和幼蟲外切葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH分別介于區(qū)間4.8～5.2和4.4～5.6之間.

*小寫字母的不同表示差異顯著(P<0.05).

2.2.4 長足大竹象外切葡聚糖酶單因素試驗結(jié)果 單因素試驗分別探討了外切葡聚糖酶表現(xiàn)出最大酶比活力的的單個最適反應(yīng)條件，結(jié)果表明，長足大竹象外切葡聚糖酶最大酶活力的單個最適反應(yīng)條件為：雌蟲在30 ℃出現(xiàn)最大值，底物濃度為2%，pH為 4.8；雄蟲在30～40 ℃之間出現(xiàn)最大值，底物濃度為2%，pH為 4.8～5.2；而對于幼蟲而言，反應(yīng)溫度為40 ℃，底物濃度為0.5%，pH為 4.4～5.6.

為了進一步驗證3個單因素對外切葡聚糖酶的影響，進行了ANOVA分析，結(jié)果表明底物濃度與pH對長足大竹象外切葡糖酶活性具有顯著影響，而反應(yīng)溫度僅對雌蟲酶活性表現(xiàn)出顯著影響(表3).

表3 單因素試驗結(jié)果的ANOVA分析

2.3 正交試驗

單因素試驗得到了外切葡聚糖酶在單個因素影響下的酶最適反應(yīng)條件，通過設(shè)計正交優(yōu)化試驗.進一步驗證和優(yōu)化長足大竹象外切葡聚糖酶在多因素影響下的最適反應(yīng)條件(表2).對正交試驗結(jié)果進行極差分析，結(jié)果表明反應(yīng)溫度對長足大竹象外切葡聚糖酶活性影響最大，其次是pH，而底物濃度對酶活性的影響最小.此外，在3種因素交互作用中pH和底物濃度對成蟲的酶活性無顯著性影響(P>0.05)，而溫度僅對幼蟲的酶活性有顯著性影響(P<0.05)(表4～5).

表4 酶活性正交試驗結(jié)果

2.4 單因素試驗與正交試驗結(jié)果比較分析

在正交試驗多因素交互作用分析結(jié)果中pH和底物濃度對成蟲的酶活性影響并不顯著，所以對于成蟲酶活性的最適反應(yīng)條件的確定主要以單因素試驗的結(jié)果為主；而幼蟲酶活性的最適反應(yīng)條件優(yōu)先考慮溫度，其次為底物濃度，最后為pH值.綜合單因素度驗和正交試驗的結(jié)果，初步推斷長足大竹象幼蟲的酶活性最適反應(yīng)條件為溫度40 ℃，pH 4.8，0.5%底物濃度；成蟲(雌)溫度為30 ℃，pH為5.2，底物反應(yīng)濃度為2%；成蟲(雄)溫度為30 ℃，pH為4.8，底物反應(yīng)濃度2%.為了驗證單因素最佳組合及正交最佳組合反應(yīng)條件下外切葡聚糖的酶活性.我們重新測定了相應(yīng)條件下外切葡聚糖的酶活性.結(jié)果如圖4所示，長足大竹象雄成蟲和幼蟲的外切葡聚糖酶活性正交優(yōu)化結(jié)果優(yōu)于單因素最佳組合酶活(P<0.01)，而雌成蟲的長足大竹象外切葡聚糖酶活性在組間無顯著差異(P>0.05).同時在單因素最佳組合或正交最佳組合反應(yīng)條件下，外切葡聚糖酶活性在蟲態(tài)間呈現(xiàn)出雌蟲>雄蟲>幼蟲的趨勢，表明在該酶不同蟲態(tài)間存在差異.

NS:差異不顯著；**：差異顯著(P<0.01).

表5 正交試驗結(jié)果方差分析

3 討論

我國的擁有豐富的竹林資源，但竹資源中竹纖維素的能源化利用率較低，從節(jié)能環(huán)保及生態(tài)的角度而言，通過生物降解的方式來逐步利用竹木質(zhì)纖維素中含有的纖維素可能將成為一種趨勢，因此迫切的需要挖掘新的生物酶資源，其中長足大竹象擁有一套優(yōu)秀的天然生物質(zhì)利用系統(tǒng)[11-12,16]，其消化道中的纖維素酶在生物降解利用方面具有重要的研究價值.

本研究以纖維素酶類中的外切葡聚糖酶為研究對象，通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計，得出長足大竹象在最適反應(yīng)條件下外切葡聚糖酶比活力，相較于取食木材木質(zhì)纖維素的桑肩天牛、光肩星天牛和松褐天牛(酶活分別為0.091、0.123、0.141 U/mL)[17]，長足大竹象外切葡聚糖酶比活力更高.此外，就酶的比活力而言，長足大竹象的內(nèi)切葡聚糖酶[13]高于外切葡聚糖酶.在本實驗中，長足大竹象外切葡聚糖酶的最適pH位于4.8～5.2之間，與Li等[18]研究來源于Caldicellulosiruptor外切葡聚糖酶反應(yīng)條件pH 4.7～5.5較為接近.長足大竹象外切葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度30 ℃～40 ℃，與家蠅幼蟲外切葡聚糖酶最適溫度50 ℃相比[19]，長足大竹象外切葡聚糖酶的最適溫度較溫和.本研究還發(fā)現(xiàn)長足大竹象成蟲外切葡聚糖酶活性大于幼蟲，存在蟲態(tài)間顯著差異，可能原因是取食習(xí)慣的差異所致[20].

外切葡聚糖酶主要參與纖維素的降解，高樹廣等[21]發(fā)現(xiàn)芝麻莖點枯病菌(Macrophominaphaseolina)產(chǎn)的纖維素酶對芝麻秸稈具有降解作用，同時于慧娟和郭夏麗[22]在篩選高效秸稈降解菌的同時發(fā)現(xiàn)外切葡聚糖酶參與了纖維素的降解過程.盡管目前在多種植食性昆蟲和農(nóng)田廢棄物中篩選和發(fā)現(xiàn)了多種纖維素降解細(xì)菌和真菌，但如何提升這些微生物分泌的纖維素酶的耐受力和提升纖維素酶的降解效率仍是難題.李建樹等從牛糞自然堆肥樣品中篩選出較耐高溫的纖維素降解細(xì)菌和真菌各一株[23].Xue等[24]從海洋黑曲霉中提取出外切葡聚糖酶并發(fā)現(xiàn)其具備耐鹽性，這些研究對纖維素降解菌或纖維素酶的耐受性方面的后續(xù)研究提供了參考價值.此外，唐自鐘等[25]利用分子生物學(xué)技術(shù)手段實現(xiàn)外切葡聚糖酶基因在畢赤酵母中成功表達(dá)，并在60 ℃下保溫一個小時仍能保持較高活性；孔芹等[26]采用基因重組技術(shù)提高了外切葡聚糖酶活性并發(fā)現(xiàn)可以提升纖維素酶總活力；此外，通過將內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶2種酶中存在的同源碳水化合物(CBM-2)融合得到融合蛋白CxnA和CxnA，在大腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌中表達(dá)有效改善了纖維素降解能力[27-28].

4 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗的結(jié)果，初步推斷長足大竹象幼蟲的酶活性最適反應(yīng)條件為溫度40 ℃，pH 4.8，0.5%底物濃度；成蟲(雌)溫度為30 ℃，pH為5.2，底物反應(yīng)濃度為2%；成蟲(雄)溫度為30 ℃，pH為4.8，底物反應(yīng)濃度2%，在對應(yīng)的最適反應(yīng)條件下，長足大竹象外切葡聚糖酶比活力分別為雌成蟲28.26 U/mg、雄成蟲26.42 U/mg、幼蟲21.50 U/mg，同時也表明該酶在不同蟲態(tài)間存在差異.綜上，本研究對長足大竹象外切葡聚糖酶最適反應(yīng)條件的研究，可以更加深入的了解長足大竹象消化道的纖維素降解酶系統(tǒng)，為挖掘外切葡聚糖酶基因和后期進一步解決竹材木質(zhì)纖維素的生物降解過程的某些技術(shù)難題提供部分參考信息.