基于流動注射化學(xué)發(fā)光的兩種Luminol體系對重樓藥材中總皂苷的分析檢測研究

王仕寶，李霞，李會寧，楊培君，張慧

(1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院秦巴山區(qū)藥(食)用植物研究所，陜西 漢中 723000；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林技術(shù)與生物工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；4.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

中藥材重樓為百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)植物，主要分布于我國云貴地區(qū)、四川南部及西藏南部等地.作為稀有藥材，具有抗腫瘤、消腫止痛、止血等功效，對治療癌癥、毒蛇咬傷、跌打損傷、咽喉腫痛等方面有顯著療效[1-3].2015年版《中國藥典》收載的重樓(rhizoma Paridis)為百合科重樓屬植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand-Maz.或七葉一枝花Parispoly-phyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara 的干燥根莖[4].目前，流動注射與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用產(chǎn)生的流動注射化學(xué)發(fā)光分析法，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品檢測方面已有一些應(yīng)用.本試驗(yàn)研究基于魯米諾(Luminol)構(gòu)建了2種化學(xué)發(fā)光體系，在適當(dāng)?shù)臈l件下，重樓皂苷對體系的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)均具有一定的抑制作用，其檢測方法表現(xiàn)出線性范圍較廣、靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn).因此，本文對重樓皂苷成分開展分析檢測，以期建立重樓藥材中對重樓皂苷的流動注射-化學(xué)發(fā)光檢測方法.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品來源于七葉一枝花Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara的根莖，于2015年8月采集于陜西省漢中市鎮(zhèn)巴縣簡池鎮(zhèn).從所采藥材中選取大小適中的根莖作為供試材料，50 ℃干燥，粉碎，過粒徑0.45 mm篩，備用.

1.2 試劑與儀器

所用主要試劑包括重樓皂苷Ⅶ(111593-200402，HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；Na2CO3，H2O2等均為分析純試劑；Luminol試劑為化學(xué)純，水為純水.

主要儀器有流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀(IFFM-E，西安瑞邁分析儀器有限公司)、多功能化學(xué)發(fā)光檢測器(IFFM-A，西安瑞邁分析儀器有限公司)；高效液相色譜儀(E2695，美國Waters公司)；超聲波清洗器(KQ3200DB，江蘇昆山超聲儀器有限公司)；電子天平(梅特勒AL204，精密度0.000 01 g)；優(yōu)普超純水機(jī)(UPH-40，成都超純科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國IKA公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SKD-Ш，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)等.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑配制 重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.05×10-2mg/mL)；Luminol儲備液(0.1 mg/mL)按照試驗(yàn)要求，稱量、溶解、置于冰箱保存，備用.其他儲備液：Cu2+溶液(1×10-2mg/mL)；H2O2溶液(質(zhì)量濃度30%H2O2溶液)，KMnO4溶液(1.0 mol/L)，H2SO4溶液(1.0 mol/L)，HCl溶液(1.0 mol/L)，H3PO4溶液(1.0 mol/L)，HNO3溶液(1.0 mol/L)等現(xiàn)用現(xiàn)配或提前配制后，置于冰箱保存.

1.3.2 供試樣品液制備 準(zhǔn)確稱取重樓樣品20.00 g，置于1 000 mL燒瓶中，用70%乙醇、液料比30∶1(mL∶g)浸泡90 min，之后在水浴鍋中加熱提取1 h(60 min/次)，連續(xù)回流提取2次，合并提取液；回收乙醇，濃縮至浸膏后用甲醇溶解定容；在此基礎(chǔ)上，采用D-101大孔樹脂純化重樓總皂苷，保存?zhèn)溆?

1.3.3 重樓皂苷 CL-FIA 分析檢測設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[5-6]，準(zhǔn)確移取重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，分別稀釋至不同濃度，備用.按照流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀的操作流程，以加入重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，空白體系的發(fā)光強(qiáng)度和加入重樓皂苷Ⅶ對照品溶液后發(fā)光強(qiáng)度的差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.從而計(jì)算樣品溶液中重樓皂苷得率.取重樓樣品溶液50 mL，按上述條件進(jìn)行檢測.根據(jù)公式計(jì)算重樓樣品溶液中重樓總皂苷含量.

(1)

式中：C為樣品溶液中重樓總皂苷濃度(μg/mL)；V為供試樣品的體積(mL)；W為稱取重樓樣品的質(zhì)量(μg)；ρ為供試溶液稀釋倍數(shù).

1.3.4 方法學(xué)考察 檢出限的計(jì)算：按照國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)相關(guān)規(guī)定，以3倍的空白標(biāo)準(zhǔn)偏差(δ)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k)之比作為檢出限，計(jì)算公式如下：

(2)

精密度試驗(yàn)：對重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.05×10-3mg/mL)，平行測定11組，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD).

加標(biāo)回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取3份已知濃度的樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入1.0，2.0、3.0 mL經(jīng)稀釋的重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)液.按照標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法測定發(fā)光強(qiáng)度，并計(jì)算回收率.

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 Luminol-H2O2體系

Luminol-H2O2體系的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線表明，體系反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈先升高至最大值，之后開始衰減的趨勢(圖1-a).在體系中將超純水換作重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)液后，變化趨勢未變，但化學(xué)發(fā)光信號明顯減弱(圖1-b).

圖1 化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線

2.1.1 流路及儀器參數(shù)的選擇 試驗(yàn)比較了不同流路對化學(xué)發(fā)光的影響[5].研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀的4條通路(a,b,c,d)分別進(jìn)行如下流路時(shí)：a為純水，b為H2O2溶液，c為金屬離子，d為Luminol溶液時(shí)，Luminol-H2O2-Cu2+體系的化學(xué)發(fā)光信號最強(qiáng)，且信號穩(wěn)定.多次試驗(yàn)結(jié)果比較，體系的發(fā)光強(qiáng)度隨著光電倍增管加載負(fù)高壓的增大而增大，同時(shí)儀器的噪音也增大.為了綜合考慮儀器的靈敏度和試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，選擇該儀器負(fù)高壓為600V，同時(shí)確定增益值為1.經(jīng)過多次對泵速的測試及比較，最終確定了理想的泵速條件，即主泵2.01 mL/min(30轉(zhuǎn))，副泵2.68 mL/min(40轉(zhuǎn))[5].

2.1.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 分別以0.1 mol/L Na2CO3，NaHCO3，NaOH和H2O為反應(yīng)介質(zhì)，考察各介質(zhì)對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明，在純水介質(zhì)中發(fā)光強(qiáng)度最大，且信號穩(wěn)定，故選純水為反應(yīng)介質(zhì).

在其他條件不變的情況下，通過多次比較優(yōu)化，確定Luminol濃度為2×10-5mg/mL(圖2)，H2O2的最佳濃度為0.03%(圖3).另外，試驗(yàn)考察了等量相同濃度的Mg2+，Mn2+和Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，對化學(xué)發(fā)光體系的增敏作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cu2+對發(fā)光強(qiáng)度的影響最大，故選擇Cu2+作為該體系的增敏劑，其最佳濃度為1.0×10-3mg/mL(圖4).

圖2 Luminol濃度對體系發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖3 H2O2體積分?jǐn)?shù)對體系發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖4 Cu2+濃度對體系發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.2 KMnO4-Luminol-H+體系

發(fā)光動力學(xué)曲線表明，在KMnO4-Luminol-H+體系中，化學(xué)發(fā)光是一個(gè)快速反應(yīng)，發(fā)光強(qiáng)度呈先快速升高至最大值，然后開始迅速衰減的趨勢(圖5-a).將超純水依次換為重樓皂苷Ⅶ后，化學(xué)發(fā)光信號分別表現(xiàn)出較大程度的減弱(圖5-b).

圖5 化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線

2.2.1 流路及儀器參數(shù)的選擇 同2.1.1.

2.2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 同2.1.2.確定該體系可選用H2SO4溶液0.30 mol/L(圖6)作為反應(yīng)介質(zhì)的最佳濃度，選擇Luminol濃度為2.0×10-5mg/mL(圖7)，KMnO4濃度為0.8×10-4mol/L(圖8)時(shí)較為適宜.

圖6 H2SO4濃度對體系發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖7 Luminol濃度對體系發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖8 KMnO4濃度對體系發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和檢出限

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確分別移取重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)液，配成梯度溶液.在優(yōu)化的最佳試驗(yàn)條件下，以加入重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，空白體系的發(fā)光強(qiáng)度和加入重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)液后體系發(fā)光強(qiáng)度的差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5].試驗(yàn)結(jié)果表明：在Luminol-H2O2體系中，重樓皂苷Ⅶ濃度在0.305～3.050 μg/mL范圍內(nèi)，與體系的相對發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，線性方程為ΔI=23.453c+8.98，R2=0.998 3(圖9).

圖9 Luminol-H2O2體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在KMnO4-Luminol-H+體系中，重樓皂苷Ⅶ濃度在0.140～2.330 μg/mL范圍內(nèi)與體系的相對發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，線性方程為ΔI= 174.871c+350.23，R2=0.997 7(圖10).

圖10 KMnO4-Luminol-H+體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 精密度和檢出限試驗(yàn) 在Luminol-H2O2體系中，對2.330 μg/mL的重樓皂苷Ⅶ對照品溶液依次平行檢測11次，RSD為2.86%(表1，圖11)；在KMnO4-Luminol-H+體系中，對1.220 μg/mL的重樓皂苷Ⅶ對照品溶液依次平行檢測11次，RSD為2.31%(表1，圖12).上述結(jié)果表明，儀器精密度較好.

圖11 重樓皂苷Ⅶ(2.330 μg/m)檢測溶液的化學(xué)光譜圖

圖12 重樓皂苷Ⅶ(1.220 μg/mL)檢測溶液的化學(xué)光譜圖

表1 兩種體系中精密度試驗(yàn)

根據(jù)公式(2)計(jì)算，在Luminol-H2O2體系和KMnO4-Luminol-H+體系中，檢出限分別為0.201 5 μg/mL和0.102 1 μg/mL.

2.4 干擾試驗(yàn)

結(jié)合文獻(xiàn)[5-7]對試驗(yàn)方法的選擇性評價(jià)，在優(yōu)化最佳條件下，發(fā)光強(qiáng)度相對誤差絕對值≤5%作為參照值，對2種發(fā)光體系中標(biāo)準(zhǔn)溶液的干擾性進(jìn)行考察.結(jié)果表明，外加多個(gè)因素均不產(chǎn)生干擾，從而說明本試驗(yàn)中，所構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光體系抗干擾能力較強(qiáng)；干擾試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2.

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品分析

按照1.3方法所制備的重樓皂苷類樣品溶液，用純水稀釋后并定容至容量瓶中，存冰箱備用；在上述優(yōu)化條件下分別檢測樣品，計(jì)算重樓皂苷的含量，兩種體系檢測結(jié)果分別為21.138 mg/g和21.317 mg/g.

為驗(yàn)證方法的可靠性，在試驗(yàn)中對重樓皂苷樣品測定時(shí)采用加標(biāo)回收方法.方法是將經(jīng)過稀釋的重樓皂苷對照品，分別加入已知濃度的樣品溶液中，制成供試品溶液(n=9).分別檢測樣品中重樓皂苷含量，并據(jù)(公式3)計(jì)算加樣回收率.對2種體系的樣品檢測，重樓皂苷平均回收率99.96%和97.23%，RSD為2.55%和2.73%.HPLC，UV及CL-FIA不同儀器檢測方法檢測結(jié)果見表3.

表3 不同方法測定重樓總皂苷含量

3 討論

1) 目前，流動注射與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用產(chǎn)生的流動注射化學(xué)分析法，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[8-11]，在Luminol-H2O2體系中，通常情況下魯米諾與H2O2的化學(xué)反應(yīng)較為緩慢，但當(dāng)金屬離子如Fe2+、Mn2+(反應(yīng)催化劑)存在時(shí)，反應(yīng)速度變得非常迅速；而且在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與金屬離子的濃度呈正比線性關(guān)系，從而為金屬離子含量的測定與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系提供檢測依據(jù)[12].研究表明，Luminol和H2O2溶液發(fā)生氧化，當(dāng)Cu2+存在時(shí)，化學(xué)發(fā)光信號相比空白體系的發(fā)光反應(yīng)強(qiáng)度呈現(xiàn)很強(qiáng)的增敏作用.在本研究Luminol-H2O2體系的溶液中，加入重樓皂苷類物質(zhì)后，試驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)光強(qiáng)度有較大程度的減弱(約減少40%).究其原因，可能是重樓皂苷與未反應(yīng)完全的H2O2發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致Luminol氧化產(chǎn)物(激發(fā)狀態(tài)的發(fā)光體，3-氨基鄰苯二甲酸鹽)的濃度降低，因此返回基態(tài)時(shí)發(fā)光強(qiáng)度表現(xiàn)為一定程度的減小.在KMnO4-Luminol-H+體系中，在酸性環(huán)境中，加入重樓皂苷后能極大地抑制發(fā)光強(qiáng)度的信號(約減少500%左右).分析原因，可能是重樓皂苷類物質(zhì)與該反應(yīng)體系中相關(guān)成分反應(yīng)生成了新的絡(luò)合產(chǎn)物，從而使得KMnO4與Luminol反應(yīng)產(chǎn)物的激發(fā)態(tài)物質(zhì)量減少，最終導(dǎo)致該體系化學(xué)發(fā)光反應(yīng)受到了抑制.有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，山奈酚對KMnO4-Luminol體系的化學(xué)發(fā)光也存在增敏作用.

2) 由于重樓藥材中皂苷類成分較多，在前期試驗(yàn)中，選擇重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅶ和薯蕷皂苷分別對兩種體系的發(fā)光抑制程度進(jìn)行比較，其3種標(biāo)品的測定結(jié)果的偏差均小于5%，但當(dāng)重樓皂苷Ⅶ作為標(biāo)品時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程的R2相對較大，檢測限較低，故在該試驗(yàn)中，選擇重樓皂苷Ⅶ作為標(biāo)品進(jìn)行重樓總皂苷的檢測設(shè)計(jì)較為合理.在Luminol-H2O2中，標(biāo)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對重樓樣品中總皂苷的含量測定為21.138 mg/g，RSD為1.05%，平均回收率為99.96%.在KMnO4-Luminol-H+體系中，總皂苷的平均含量測定為21.317 mg/g，RSD為1.09%，平均回收率為97.23%.在Luminol-H2O2和KMnO4-Luminol-H+2種體系中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，重樓皂苷對上述體系的發(fā)光反應(yīng)均具有抑制作用，2種檢測方法表現(xiàn)出線性范圍較廣、靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)，因此構(gòu)建的檢測重樓皂苷類物質(zhì)的CL-FIA方法，檢測結(jié)果較為理想.結(jié)合表3比較表明，CL-FIA，HPLC或UV對重樓總皂苷檢測結(jié)果略有差異；CL-FIA檢測皂苷類平均含量略低于UV，而回收率略高于UV；但CL-FIA檢測相對UV方法體現(xiàn)出很寬的線性范圍和較低的檢出限.Luminol作為化學(xué)發(fā)光試劑，可以組合多種化學(xué)發(fā)光體系，可廣泛用于藥物的含量測定[14-15].此外，通過綜合比較2種發(fā)光檢測體系，KMnO4-Luminol-H+體系的檢測范圍較寬、檢出限更低、靈敏度較高，故在實(shí)際應(yīng)用中可用于重樓皂苷類化合物的檢測和含量控制.