吡蟲啉對豌豆蚜抗感品系兩種解毒酶活力的影響

郭耀霞，劉長仲，張廷偉，漆富苗，張東鵬

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

豌豆蚜(AcyrthosiphonpisumHarris)屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，分布于全球各地[1]，繁殖力很強(qiáng)，對我國北方豆類作物以及苜蓿生產(chǎn)造成重大威脅[2]，其危害除直接吸食寄主植物汁液外還傳播多種病毒[3-4].目前，化學(xué)防治是防治豌豆蚜最有效的方法，而吡蟲啉作為一種新型煙堿類殺蟲劑，具有低毒、低殘留、高效、廣譜、內(nèi)吸性等特點(diǎn)，被作為當(dāng)前防治刺吸式害蟲的高效藥劑大量使用[5]，進(jìn)而豌豆蚜對吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑的抗性問題也將成為害蟲防治中的首要任務(wù).有關(guān)害蟲對吡蟲啉的抗性已有不少報道，如褐飛虱(Nilaparvatalugens)[6]、二斑葉螨(Tetranychusurticae)[7]、蘋果黃蚜(Aphiscitricola)[8]、麥長管蚜(Sitobionavenae)[9-10]、棉蚜(Aphisgossypii)[11]、桃蚜(Myzuspersicae)[12]等.害蟲抗性的形成與體內(nèi)各種解毒酶系的活性變化有密切聯(lián)系，如趙穎[13]等研究表明棉蚜的抗性程度與羧酸酯酶的活性呈正相關(guān)；高新菊[14]等研究表明隨著二斑葉螨抗性增強(qiáng)，其體內(nèi)的多功能氧化酶(multifunctional oxidase，MFO)活性也逐漸上升；汝陽[15]等研究發(fā)現(xiàn)二斑葉螨在對阿維菌素的代謝過程中，其體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GSTs)和MFOs起主要作用，羧酸酯酶(carboxy lesterase，CarEs)對阿維菌素的代謝影響較小.乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和CarEs作為昆蟲體內(nèi)重要解毒酶也曾被報道，如潘文亮等[16]研究了棉蚜對吡蟲啉的低水平抗性是由于CarEs酶活性的增加造成的；李飛等[17]研究表明棉蚜抗性品系與敏感品系相比，乙酰膽堿酯酶的活力顯著升高.當(dāng)前在關(guān)于豌豆蚜抗性發(fā)展過程中，其解毒酶活性變化的研究報道較少，如王小強(qiáng)等[18]研究表明對豌豆蚜F1代進(jìn)行藥劑處理后，對其壽命和繁殖力均有抑制作用；陳小坤等[19]研究抗吡蟲啉棉蚜種群對啶蟲脒和噻蟲胺的交互抗性及相關(guān)酶學(xué)機(jī)理，說明吡蟲啉引起棉蚜種群靶標(biāo)突變后，抗性棉蚜種群不僅達(dá)到了高抗水平，而且停藥后很難再恢復(fù)至相對敏感水平；韓曉莉等[9]對麥長管蚜抗性品系和敏感品系進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)隨著選育世代增加，成蚜期和生殖期明顯縮短，產(chǎn)蚜量逐漸下降.本研究參照潘文亮[16]和李飛等[17]研究棉蚜抗性品系體內(nèi)CarEs和AChE活性升高時，棉蚜對吡蟲啉產(chǎn)生低水平抗性，選擇測定紅綠兩種色型豌豆蚜敏感品系和抗性品系體內(nèi)AChE和CarEs活性變化規(guī)律，旨在了解豌豆蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗藥性的強(qiáng)弱以及抗性發(fā)展動態(tài)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中吡蟲啉的合理使用和豌豆蚜的綜合防治提供科學(xué)的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及植物

供試植物為蠶豆(ViciafabaL.)，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)敏感品系種群采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)田，期間未接觸過任何化學(xué)農(nóng)藥.豌豆蚜抗性品系是由敏感品系在室內(nèi)經(jīng)多代藥劑處理培育獲得.飼養(yǎng)時以蠶豆為寄主(接觸藥劑后每2代測定1次)，以敏感品系作為對照.

1.2 主要試劑及儀器

98.5%吡蟲啉原藥(青島海利爾藥業(yè)有限公司).乙酸-1-萘酯(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；碘化乙酰硫代膽堿(上海源葉生物科技有限公司)；固藍(lán)RR鹽(BIOSHARP)；牛血清蛋白(BSA，上海源聚生物科技有限公司)；毒扁豆堿(上海維塔化學(xué)藥劑有限公司)；a-萘酚(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司北京代表處)，離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司).

1.3 毒力測定

毒力測定方法采用聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦的帶蟲浸葉法[20].將吡蟲啉原藥用丙酮溶解后稀釋成6個濃度梯度(0.1、0.25、0.5、1、2、4 mg/L)，將帶有豌豆蚜的蠶豆葉片用紗布包裹后在不同濃度的藥液中浸3～5 s后，放置在培養(yǎng)皿中自然涼干；置于溫度24 ℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每濃度處理90頭，每處理3次重復(fù)，以丙酮為對照.48 h后用毛筆輕觸蟲體檢查結(jié)果，蟲體附肢完全不動者記為死亡，統(tǒng)計不同色型豌豆蚜死亡數(shù).用SPSS 16.0計算LC50值.

1.4 抗性品系的選育

豌豆蚜抗性品系的選育方法參照王開運(yùn)[21]的測定方法(略有改動)，將吡蟲啉采用噴霧法對豌豆蚜敏感品系進(jìn)行噴霧處理，控制死亡率在70%左右，以存活個體繼續(xù)擴(kuò)繁，連續(xù)選育6代，誘導(dǎo)得到抗性品系.

1.5 酶活力測定

1.5.1 酶液制備 取10頭無翅成蚜放入1.5 mL離心管，先加入250 μL預(yù)冷的0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液冰浴研磨3 min，將勻漿液在4 ℃下10 000g/min離心15 min，取上清液作為粗酶液，冰浴待用.

1.5.2 酶蛋白含量測定 測定方法參照Bradford[22]的染色法(略有改動).在試管中加入粗酶液0.1 mL再加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，設(shè)置對照.置于25 ℃下恒溫水浴 2 min在595 nm下測定D值，求出粗酶液蛋白含量.

1.5.3 乙酰膽堿酯酶活性測定 活性測定方法參照Gorun[23]的測定方法(略有改動).在酶標(biāo)板中加入粗酶液，再加入pH 7.0磷酸緩沖液二硝基苯甲酸(DTNB)溶液和碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)溶液，在酶標(biāo)儀中25 ℃條件下405 nm處讀取D值變化，進(jìn)而得出乙酰膽堿酯酶比活力.

1.5.4 羧酸酯酶活性測定 測定方法參照Asper-en[24]的方法(略有改進(jìn)).將粗酶液加入酶標(biāo)板孔中，再依次加入α-乙酸萘酯，在35 ℃條件下450 nm處讀取D值變化，求得羧酸酯酶比活力.

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，毒力測定結(jié)果采用SPSS16.0軟件One-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，計算LC50值，并利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析；抗性倍數(shù)(resistance ratio，RR)=處理種群LC50/敏感種群LC50.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性選育結(jié)果

在抗性篩選過程中，豌豆蚜對吡蟲啉的抗性檢測結(jié)果見表1.由生物測定結(jié)果得出紅綠色型豌豆蚜對吡蟲啉的抗性隨著篩選世代的增加而緩慢上升，連續(xù)篩選6代后，紅綠色型豌豆蚜對吡蟲啉的敏感度(LC50值)分別由選育前(F0)的0.149 2 mg/L，0.136 3 mg/L提高為選育后(F6)的0.499 0 mg/L、0.429 9 mg/L；抗性分別增長了3.34和3.15倍，紅色型平均每代上升0.56倍，綠色型平均每代上升0.52倍.在生物測定過程中，不同色型豌豆蚜毒力回歸方程斜率(b值)均減小，表明了不同色型豌豆蚜的群體中抗性個體會發(fā)生異質(zhì)性變化而不穩(wěn)定，所以豌豆蚜群體的抗性倍數(shù)有可能還會增加.

表1 豌豆蚜抗性選育結(jié)果

2.2 吡蟲啉對兩種色型豌豆蚜AChE比活力的影響

用吡蟲啉處理后豌豆蚜體內(nèi)AChE比活力變化見表2，不同色型豌豆蚜體內(nèi)乙酰膽堿酯酶比活力隨著選育世代的增加均有顯著升高，綠色型F8代AChE比活力達(dá)到19.25 μmol/(min·mg)，活性比從1.00升高為2.98；紅色型F8代AChE比活力達(dá)到23.03 μmol/(min·mg)，活性比升為4.11.通過吡蟲啉處理后2種色型豌豆蚜體內(nèi)AChE比活力均有所增加，表明吡蟲啉對AChE比活力顯著增強(qiáng)有關(guān).

表2 豌豆蚜吡蟲啉抗性選育過程中AChE活性變化

2.3 吡蟲啉對兩種色型豌豆蚜CarEs比活力的影響

豌豆蚜對吡蟲啉抗性選育過程中，隨著篩選代數(shù)的增加，不同色型豌豆蚜F1～F8抗性品系體內(nèi)羧酸酯酶比活力均有所提高，綠色型豌豆蚜 F8代CarEs比活力升高為28.29 μmol/(min·mg)，CarEs活性比達(dá)到2.76；紅色型F8代CarEs比活力達(dá)到32.03 μmol/(min·mg)，CarEs活性比為2.34.說明豌豆蚜對吡蟲啉的解毒代謝與其體內(nèi)解毒酶CarEs息息相關(guān).

表3 豌豆蚜吡蟲啉抗性選育過程中CarEs活性變化

3 討論

當(dāng)前，化學(xué)防治作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中害蟲的主要防治措施，導(dǎo)致了害蟲的抗藥性日趨嚴(yán)重，為化學(xué)殺蟲劑的使用帶來嚴(yán)重的阻礙，所以明確害蟲抗藥性的發(fā)生規(guī)律及其機(jī)制是害蟲抗藥性治理的基礎(chǔ)[25].近年來，有很多關(guān)于害蟲抗藥性的報道，如陳亮[26]等研究桃蚜對吡蟲啉交互抗性研究，得到抗性桃蚜種群；帥霞[12]等通過對桃蚜種群世代選育，測得桃蚜種群抗性品系體內(nèi)3解毒酶(堿性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶和多功能氧化酶)活性有升高的趨勢；劉澤文[6]等用吡蟲啉對褐飛虱進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)褐飛虱種群抗性倍數(shù)明顯增加；Visetson等[27]曾研究了氯氰菊酯作用于小菜蛾后對其生長發(fā)育及體內(nèi)單氧酶和酯酶活性的影響，結(jié)果表明解毒酶活性變化是小菜蛾產(chǎn)生抗性的重要原因；Yu等[28]研究了5種殺蟲劑增效劑促進(jìn)不同害蟲不同蟲態(tài)環(huán)氧酶活性增加；陳澄宇[29]曾研究了昆蟲為適應(yīng)不良環(huán)境條件其體內(nèi)解毒酶活性增強(qiáng)，幫助昆蟲代謝殺蟲劑以降低危害.綜上所述，可以得出昆蟲解毒酶活性的變化是昆蟲產(chǎn)生抗性的主要原因，解毒酶活性的升高促進(jìn)了昆蟲對殺蟲劑的代謝，進(jìn)而維持自身正常的生長發(fā)育.

本文所研究的豌豆蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性，綠色型F8代AChE比活力達(dá)到19.25 μmol/(min·mg)，活性比從1.00升高為2.98；CarEs比活力升高為28.29 μmol/(min·mg)，CarEs活性比達(dá)到2.76.紅色型F8代AChE比活力達(dá)到23.03 μmol/(min·mg)，活性比升為4.11；CarEs比活力達(dá)到32.03 μmol/(min·mg)，CarEs活性比升為2.34；且2種解毒酶比活力均是紅色型較綠色型升高更顯著.此結(jié)論與常靜[30]等報道的4種殺蟲劑影響桃蚜AChE比活力升高的結(jié)論是一致的.但本試驗(yàn)僅測定了豌豆蚜抗性品系A(chǔ)ChE和CarEs酶活性變化，而昆蟲抗性產(chǎn)生還可能跟體內(nèi)其他解毒酶活性相關(guān)，所以，為制定合理的豌豆蚜防治方案，今后還需進(jìn)一步研究其體內(nèi)其他解毒酶活性變化，為更深入了解豌豆蚜對吡蟲啉抗性規(guī)律提供科學(xué)佐證.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對紅綠色型豌豆蚜連續(xù)8代施用吡蟲啉，測定AChE和CarEs 兩種解毒酶比活力，比較紅綠兩種色型豌豆蚜活性比變化規(guī)律，結(jié)果表明不同色型豌豆蚜在吡蟲啉抗性選育過程中隨著抗性選育代數(shù)增加，其體內(nèi)AChE和CarEs 兩種解毒酶比活力均有所提高，說明AChE和CarEs 2種解毒酶在豌豆蚜對吡蟲啉代謝解毒過程中具有十分重要的作用，但是否由于解毒酶系比活力變化而導(dǎo)致豌豆蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗藥性還需深入研究.因此，解毒酶活性升高也只是表明豌豆蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性的原因之一.