健康與腹瀉犢牛的糞便真菌差異分析

金磊，朱肖亭，施巧婷，王二耀，徐照學(xué)，王培育，張子敬

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；3.河南省畜牧規(guī)劃設(shè)計研究院，河南 鄭州 450000)

犢牛腹瀉是哺乳期犢牛由于各種原因引起的以腹瀉為主要特征的疾病，本病一年四季均可發(fā)生，為牛場常見的疾病.犢牛長期腹瀉會造成生長發(fā)育不良，嚴重可導(dǎo)致死亡，是造成養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失的主要原因之一[1].在大規(guī)模飼養(yǎng)時，犢牛腹瀉發(fā)生率可達90%，死亡率最高可達50%以上，給牛場造成巨大經(jīng)濟損失,嚴重阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展.犢牛腹瀉的致病原因有感染性腹瀉和非感染性腹瀉.非感染性因素主要包括飼養(yǎng)管理不當(dāng)、飼料質(zhì)量變質(zhì)、應(yīng)急因素等引起的腹瀉[2]；飼料儲存過程中，由于通風(fēng)或光照不足，很容易造成飼料的霉變和腐敗.牛誤食了該類的飼料，很容易引起腹瀉[3].變質(zhì)腐敗的飼料應(yīng)及時清理，發(fā)生霉變的料庫，需進行熏蒸消毒后方可使用，以免再次污染[4].感染性因素主要包括細菌性、病毒性、真菌性和寄生蟲性等原因引起的腹瀉[5].健康動物腸道菌群間按一定比例相互依存、相互制約、相互影響達到平衡的一種狀體[6].真菌廣泛存在于自然界，屬于條件性致病菌，當(dāng)機體免疫力降低或長期使用抗生素、激素等藥物時，導(dǎo)致真菌大量繁殖，腸道內(nèi)菌群之間的平衡被打破，從而引起腹瀉[7].有研究表明腸道菌群可以提供維生素和能量，在維持宿主健康方面起著重要作用[8]，而真菌可產(chǎn)生不同種類的纖維素降解酶，在對纖維降解中發(fā)揮重要作用[9].尤其是由多種化學(xué)鍵復(fù)合而形成的天然木質(zhì)纖維素很難被單一水解酶而降解，而厭氧真菌憑借能產(chǎn)生多種高活性的酶，能夠穿透植物表面角質(zhì)層及細胞壁木質(zhì)化組織，從而達到降解和利用的作用[10-11].Gomez[12]和張子敬[13]等都報道了，關(guān)于腹瀉犢牛與健康犢牛之間的細菌組成與結(jié)構(gòu)差異，而關(guān)于真菌對犢牛腹瀉的相關(guān)研究卻鮮有報道.

本研究利用高通量測序技術(shù)，對駐馬店某牛場健康犢牛與腹瀉犢牛的18S rRNA基因及rDNA ITS區(qū)進行了序列分析，比較其真菌組成與結(jié)構(gòu)差異，以期明確引起犢牛腹瀉的病因，為犢牛腹瀉的預(yù)防、治療提供新思路.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從駐馬店規(guī)模化養(yǎng)殖場中采集夏南牛1月齡左右犢牛腹瀉糞便樣品10份和健康犢牛糞便樣品10份，每份樣品來自不同犢牛.腹瀉犢牛糞便特征為乳白色，水液狀且?guī)д骋簵l，利用滅菌醫(yī)用棉簽蘸取發(fā)病時間1～2 d腹瀉犢牛肛門處糞便樣品.健康犢牛糞便同樣采用滅菌醫(yī)用棉簽收集.所有樣品經(jīng)干冰運輸至實驗室，-80 ℃保存.

1.2 樣品總DNA提取

使用Power Soil DNA Isolation Kit(MOBIO Laboratories)試劑盒，按照說明書提取樣品中總DNA，并測定其濃度.用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性.

1.3 ITS基因擴增

ITS-1(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))基因PCR擴增引物：ITS-1F5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS-2R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′.該PCR反應(yīng)體系包含0.3 μL Vn F(10 μmol/L)，0.3 μL Vn R(10 μmol/L)，5 μl KOD FX Neo Buffer，2 μL dNTP(2 mmol/L)，0.2 μL KOD FX Neo，加去離子水至10 μL.擴增體系為95 ℃預(yù)變性5 min，25個循環(huán)(95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸7 min.120 V電壓40 min電泳后，用1.8%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行檢測.

1.4 高通量測序

利用Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，對純化后的合并樣品進行真菌rRNA基因構(gòu)建小片段文庫進行測序.

1.5 統(tǒng)計分析

將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)使用FLASH軟件，對每個樣品的reads進行拼接，得到原始Tags數(shù)據(jù)；使用Trimmomatic軟件，對拼接得到的原始Tags數(shù)據(jù)進行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(clean tags)，使用UCHIME軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(effective tags).使用QIIME軟件中的UCLUST對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并在界、門、綱、目、科、屬個水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)進行統(tǒng)計，并基于UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學(xué)注釋.使用Mothur軟軟件，評估樣品Alpha多樣性，采用Ace、Chao、Simpson和Shannon評估指數(shù)對樣本進行alpha多樣性分析.Beta多樣性通過QIIME軟件分析，基于加權(quán)算法(bray-curtis)計算4種距離矩陣，使用R語言工具繪制樣本的主坐標(biāo)分析(PCoA).健康組和腹瀉組糞便微生物中采用Wilcoxon秩和檢驗方法分析物種顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 生物群落多樣性分析

20個犢牛糞便樣品中平均每個樣本的有效序列數(shù)為69 847個，平均有效序列數(shù)為300 bp，基于97%相似度聚類OTU，共得到6 072個OTU.2組Alpha多樣性分析如表1所示，所有樣本群落覆蓋度均超過99%，說明該測序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實情況.Ace和Chao1指數(shù)表明2組間物種豐富度無顯著差異(P>0.05)，Simpson和Shannon指數(shù)表明兩組間微生物的多樣性無顯著差異(P>0.05).

表1 兩組樣本Alpha多樣性

健康和腹瀉犢牛的糞便中微生物群落結(jié)構(gòu)進行主坐標(biāo)分析(PCoA)表明2組間主成分(PC1、PC2和PC3)占有40.8%的樣本組成差異，2組樣本的微生物群落組成可以相互區(qū)分(圖1).

J2代表健康組；F2代表腹瀉組.

2.2 不同層次微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在門的分類水平上，對豐度在前20的微生物進行分析，其中腹瀉犢牛組中子囊菌門(Ascomycota，83.68%)、新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota，2.44%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，2.16%)占主導(dǎo)地位，約占真菌總數(shù)的88.28%；健康犢牛組中子囊菌門(72.85%)、新麗鞭毛菌門(8.13%)、被孢霉門(Mortierellomycota，1.27%)為優(yōu)勢菌(如圖2-A)，約占真菌總數(shù)的82.25%.在腹瀉犢牛糞便樣品中檢出了芽枝霉門，健康犢牛樣品中無該菌門.在屬的分類水平上，對豐度在前19的微生物進行分析，其中健康犢牛組中排名較高的菌屬依次為酵母菌屬(Saccharomyces，29.46%)、嗜熱真菌屬(Thermomyces，5.47%)、曲霉屬(Thermomyces，4.16%)、盲囊菌屬(caecomyces，1.86%).腹瀉組中相對豐度較高的菌屬則依次為嗜熱真菌屬占7.00%、曲霉屬占6.13%，鬼傘屬(Coprinopsis，3.67%).并且腹瀉犢牛糞便樣品中發(fā)現(xiàn)彎孢屬而健康犢牛中則未檢查該菌屬(圖2-B).

圖2 健康組和腹瀉組樣本在門水平(A)和屬水平(B)上的糞便微生物組成結(jié)構(gòu)

2.3 糞便菌群物種差異分析

在門的分類水平上，健康組與腹瀉組之間有明顯差異的菌門有新麗鞭毛菌門、擔(dān)子菌門和芽枝霉門(Blastocladiomycota)共3種(圖3-A).與健康組比較，腹瀉犢牛糞便中新麗鞭毛菌門相對豐度顯著降低，而擔(dān)子菌門和芽枝霉門顯著升高(P<0.05).在屬的分類水平上對排名前19的菌屬進行分析發(fā)現(xiàn)，腹瀉組與健康組犢牛樣品之間有明顯差異的菌屬有6種(圖3-B).相較于健康犢牛組，腹瀉組中酵母屬(Saccharomyces)、盲囊菌屬和小脆柄菇屬(Psathyrella)相對豐度明顯降低，而彎孢屬(Curvularia)、赤霉菌屬(Gibberella)和耐干霉菌屬(Xeromyces)豐度顯著升高(P<0.05).

圖3 健康組和腹瀉組樣本樣本在門水平(A)和屬水平(B)上的物種差異分析

3 討論

近年來由于經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們生活水平不提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，對營養(yǎng)價值高、口味獨特的牛肉和牛奶的需求大幅增長，但國內(nèi)牛肉和牛奶產(chǎn)能無法滿足市場需求，而犢牛腹瀉疾病則是制約養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一.有研究發(fā)現(xiàn)腸道真菌紊亂是導(dǎo)致炎癥性腸病的主要因素，而引起腹瀉[14].因此，開展?fàn)倥８篂a病原菌的研究具有十分重要的意義.

本研究通過高通量測序技術(shù)分析了健康犢牛和腹瀉犢牛真菌的微生物多樣性特征.健康犢牛與腹瀉犢牛群體間的真菌多樣性的豐度和均勻度均無顯著差異(P>0.05)，這與前人關(guān)于健康與腹瀉牦牛間微生物多樣性一致[15-16].腹瀉犢牛樣品的新麗鞭毛菌門含量顯著低于健康犢牛組(P<0.05)，Li等[15]在牦牛上也有相同結(jié)果.該門內(nèi)真菌被普遍認為具有解聚復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的能力，可降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)、提高動物飼料消化率、產(chǎn)生沼氣等功能[17].這可能與腹瀉導(dǎo)致犢牛消化能力降低有關(guān).腹瀉組中擔(dān)子菌門顯著升高(P<0.05)，酵母菌屬顯著低于健康組，而酵母菌則具有抗菌消炎、抗病毒、提高動物機體免疫力等功能[18]，推測腹瀉可能與犢牛的腸道炎癥有關(guān).Sokol等人對人的炎癥性腸病(IBD)中真菌分析發(fā)現(xiàn)，患者中的擔(dān)子菌門比例增加，抗炎真菌酵母菌比例減小[19]，這與本研究結(jié)果相一致.

在腹瀉犢牛組中未檢出盲囊菌屬，與健康組相比差異顯著(P<0.01).有研究發(fā)現(xiàn)盲囊菌屬可分泌產(chǎn)生具有氨基酶活性的蛋白酶[20]，該酶可提高動物對蛋白質(zhì)飼料的消化利用.說明可能由于腹瀉導(dǎo)致犢牛對蛋白質(zhì)的消化利用不完全.腹瀉組中彎孢屬豐富度顯著升高(P<0.05)，可能由于犢牛誤食了具有彎孢菌葉斑病的青貯玉米.與健康組相比腹瀉組赤霉菌屬豐富度明顯升高(P<0.05)，有研究表明赤霉菌可導(dǎo)致仔豬胃腸道功能障礙(腹瀉，嘔吐)等癥狀[21].本研究推測可能由于飼料受到赤霉菌屬的污染引起赤霉素中毒，引起犢牛腸道菌群紊亂(有益菌降低如酵母菌，有害菌升高如赤霉菌)，從而導(dǎo)致腹瀉.耐干霉菌屬在腹瀉組中豐富度也是明顯升高，但是關(guān)于該菌屬在動物體內(nèi)發(fā)揮的功能尚不清楚.

4 結(jié)論

綜上所述，健康與腹瀉犢牛真菌間存在多個水平的顯著差異，有關(guān)真菌對腹瀉犢牛腸道的相關(guān)機制作用還需進一步研究.