CYP19基因在牦牛睪丸及附睪組織中的表達(dá)定位

羅文澤，郭憲，胡俊杰，葛聞博，段宏偉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

牦牛生活在青藏高原海拔3 000 m以上的地區(qū)，其對(duì)低溫、低氧、低壓的高原環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能充分利用其他家畜難以利用的高山草原，是高原地區(qū)牧民的主要經(jīng)濟(jì)來源[1].牦牛全年不補(bǔ)飼，牦牛營(yíng)養(yǎng)水平不高，造成“夏肥秋壯，冬瘦春乏”的惡性循環(huán)，并且缺乏科學(xué)的飼養(yǎng)管理模式，因此牦牛3年兩胎或2年1胎的繁殖能力普遍低于其它普通牛屬動(dòng)物.

哺乳動(dòng)物睪丸是一個(gè)復(fù)雜的器官，主要功能是合成睪酮和產(chǎn)生精子.眾所周知，睪丸的正常發(fā)育和精子生成的維持是由促性腺激素和睪丸局部分泌的激素控制的[2].除了雄激素外，雌激素對(duì)睪丸及附睪發(fā)育也有著重要作用，是睪丸發(fā)育中主要的系統(tǒng)性調(diào)節(jié)因子之一.如雌激素通過影響睪丸輸出小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)和重吸收功能間接影響睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生[3].在哺乳動(dòng)物睪丸中，雌激素的主要來源是由雄激素通過芳香化酶(P450arom)轉(zhuǎn)化而來[4]，P450arom在山羊[5]、哥根廷小型豬[6]、大鼠[7]、小鼠[8]、棕熊[9]中均有報(bào)道.研究發(fā)現(xiàn)，在雄性生殖系統(tǒng)中，包括輸出小管、附睪、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞與精細(xì)胞中亦存在雌激素[10]，雌激素通過影響睪丸輸出小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)和重吸收功能來間接影響睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生[11].

CYP19基因編碼的芳香化酶P450arom，后者是雌激素合成的最后一步關(guān)鍵酶.不同組織中，P450arom的含量和活性及其最終發(fā)揮的功能各有不同，這是隨CYP19等位基因頻率變化而改變[12].當(dāng)CYP19等位基因的發(fā)生頻率升高時(shí)，P450arom的活性明顯增強(qiáng)，這種基因頻率變化同時(shí)伴有血液中雌二醇和睪酮的水平升高[13].因此，睪丸及附睪局部CYP19基因的表達(dá)及雌激素的合成對(duì)其發(fā)育有重要作用.而目前對(duì)于CYP19基因在牦牛睪丸及附睪中的表達(dá)定位尚不明確，本試驗(yàn)擬對(duì)CYP19在成年牦牛睪丸及附睪中表達(dá)進(jìn)行分析，以期為研究CYP19在成年牦牛生殖中的調(diào)節(jié)作用提供一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑及試驗(yàn)動(dòng)物 4%組織細(xì)胞固定液(索萊寶)、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天)、免疫組化染色試劑盒(博奧森)、中性樹膠(索萊寶)；全蛋白提取試劑盒(強(qiáng)，索萊寶)、SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(碧云天)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)、P450arom抗體(Abcam)、GAPDH抗體(博奧森)；總RNA提取試劑盒(索萊寶)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa)；常規(guī)試劑等.

以3頭6歲左右的健康青海門源公牦牛作為試驗(yàn)動(dòng)物.試驗(yàn)牛處死后迅速采集睪丸、附睪組織，將部分組織樣分裝于1.5 mL EP管中置于液氮罐中快速冷凍過夜后，轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱存放備用，其余部分經(jīng)固定液(4%多聚甲醛溶液)固定用于免疫組織化學(xué).

1.1.2 儀器設(shè)備 熒光定量PCR儀(美國(guó)Biodine Rad公司)、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Biodine Rad公司)、瓊脂糖水平電泳槽電泳儀(美國(guó)Biodine Rad公司)、電子天平(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)、冷凍離心機(jī)(德國(guó)Ependorff公司)、石蠟切片機(jī)(徠卡-2016，德國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、常規(guī)儀器等.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 常規(guī)Trizol法提取樣本總RNA，應(yīng)用核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度以及D值，模板選用D值在1.8～2.0之間的RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA，以GAPDH基因的特性引物進(jìn)行電泳，出現(xiàn)亮條帶的cDNA在編號(hào)之后，-20 ℃保存，剩余RNA保存于-80 ℃.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Gen Bank中公布的牦牛CYP19cDNA序列，選用GAPDH為內(nèi)參基因，用Primer 5.0設(shè)計(jì)CYP19和GAPDH的引物.使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR.引物送由西安擎科公司合成.

1.2.3 qRT-PCR 使用TB GreenTM Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，采用20 μL體系在qRT-PCR儀上擴(kuò)增，設(shè)置4個(gè)重復(fù)組，以保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性.程序?yàn)?95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s；72 ℃，2 min，共45個(gè)循環(huán).每個(gè)樣本設(shè)置4次重復(fù)，以保證樣本中靶基因相對(duì)表達(dá)的準(zhǔn)確性.使用GAPDH作為參照基因如表1，以2-ΔΔCT方法測(cè)定CYP19基因的相對(duì)表達(dá).

表1 引物信息

1.2.4 Western blot 取出樣品在液氮中研磨成粉末狀，按照30 μg組織粉末加入1.5 mL RIPA裂解液(強(qiáng))和15 μL PMSF(100 mmol/L)對(duì)粉末進(jìn)行充分震蕩溶解并于冰上放置1 h進(jìn)行組織裂解；之后使用低溫離心機(jī)離心(4 ℃，13 000 r/min，20 min)；離心后吸取上清備用；SDS-PAGE電泳檢測(cè)：配制10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)，并確定最佳的蛋白上樣量進(jìn)行后續(xù)的Western-blot 操作；完成SDS-PAGE操作后，紫外激發(fā)后觀察蛋白電泳狀況，之后將此蛋白膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后用Bio-Rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作；將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，加入TB-transfer buffer(恒流：400 mA)轉(zhuǎn)膜2 h；封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，使用WB Enhancer Solution處理膜 10 min，之后用PBS洗凈，再用5%的脫脂奶粉(用 PBS 配置)封閉液進(jìn)行封閉，室溫下2 h或者4 ℃封閉過夜；加入P450arom或GAPDH抗體(稀釋度1∶1 000)；洗膜：PBST(PBS+0.1%Tween 20)洗5次，每次5 min；加入二抗：每個(gè)目標(biāo)蛋白的二抗(稀釋度1∶5 000)；洗膜：PBST洗5次，每次5 min后，加入超敏化學(xué)發(fā)光液處理3～5 min后曝光.

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 將包埋的睪丸及附睪組織蠟塊制成厚度4～6 μm的切片后用于免疫組織化學(xué)染色.將切片置于40 ℃烘箱中烤片過夜后，根據(jù)免疫組化試劑盒(PV-0023、PV-0024，GBI公司，美國(guó))中的操作步驟，切片經(jīng)脫蠟，脫水，抗原修復(fù)，3% H2O2去離子水孵育，PBS洗滌后滴加封閉液室溫封閉30 min，隨后分別滴加一抗(1∶100)和 PBS(陰性對(duì)照)，于 4 ℃孵育過夜，洗后滴加二抗并于37 ℃孵育30 min，洗后依次經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(博奧森生物技術(shù)有限公司，北京)顯色、水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片，并在BA400Digital顯微鏡下觀察拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 P450arom在牦牛睪丸及附睪上的表達(dá)定位

免疫組化結(jié)果顯示：P450arom蛋白在附睪頭、體、尾的上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞、精細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均有表達(dá).在附睪頭組織中P450arom蛋白主要表達(dá)在精細(xì)胞和上皮細(xì)胞中；在附睪體和附睪尾中P450arom蛋白主要表達(dá)在上皮細(xì)胞和基底細(xì)胞中.在睪丸中，P450arom蛋白主要表達(dá)在精原細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中(圖1).

P450arom：目的蛋白；Control：對(duì)照；S：精子；BC：基底細(xì)胞；EEC：附睪上皮細(xì)胞；LC：間質(zhì)細(xì)胞；SC：支持細(xì)胞；Sm：平滑肌細(xì)胞；Spg：精原細(xì)胞.

2.2 CYP19mRNA在牦牛睪丸及附睪中的表達(dá)

熒光定量結(jié)果顯示，CYP19mRNA在牦牛睪丸和附睪頭、體、尾中均有表達(dá).CYP19mRNA在睪丸中表達(dá)量極顯著高于附睪頭、體、尾(P<0.01)，在附睪體中表達(dá)量最低，并且隨著附睪尾、附睪頭、附睪體表達(dá)依次遞減(圖2).

以GAPDH為內(nèi)參基因，表示字母不同表示P<0.01.

2.3 P450arom蛋白在牦牛睪丸及附睪中的表達(dá)

Western-blot 結(jié)果顯示：P450arom蛋白在牦牛睪丸及附睪頭、體、尾中均有表達(dá).運(yùn)用Image J 軟件分析得知：P450arom蛋白在附睪頭表達(dá)量顯著高于睪丸、附睪體、附睪尾(P<0.05)，而在睪丸、附睪體、附睪尾中表達(dá)量無顯著差異(圖3).

以GAPDH作為對(duì)照.數(shù)據(jù)表示字母不同表示P<0.05.

3 討論

根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，附睪分為附睪頭、體、尾.睪丸輸出小管及部分附睪管構(gòu)成附睪頭部，另外一部分附睪管構(gòu)成附睪的體部與尾部.睪丸輸出小管一端從睪丸網(wǎng)發(fā)出，另一端通入附睪管，附睪管中有纖毛結(jié)構(gòu)，纖毛擺動(dòng)有利于精子運(yùn)動(dòng)[14].附睪管管壁有較多平滑肌細(xì)胞，可以將精子向下一級(jí)管道輸送，附睪管的主要功能是吸收破碎的精子和脫落下來的殘余小體，此外還可分泌甘油磷酸膽堿、唾液酸蛋白等功能[15].精子在曲細(xì)精管中尚未完全成熟，還需要附睪的分泌物及一些因子的作用下，發(fā)生一系列形態(tài)、生理、機(jī)能上的成熟過程才具備受精能力，附睪頭、體部是精子發(fā)育成熟的部位，尾部是精子貯存的部位，附睪是精子成熟的關(guān)鍵部位[16].因此，附睪的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存精子，并使其成熟.

維持附睪轉(zhuǎn)運(yùn)精子和精子成熟功能的主要雄激素是雙氫睪酮，而雙氫睪酮是在5α-還原酶作用下將睪酮轉(zhuǎn)化而成，雙氫睪酮能夠促進(jìn)睪丸及附睪的正常發(fā)育，以及促進(jìn)第二性征的出現(xiàn)及維持，對(duì)于精子在附睪處的成熟具有重要作用[17].在雄激素的調(diào)控下，附睪上皮細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)、糖蛋白和磷脂，這些對(duì)精子的成熟和生存至關(guān)重要.缺乏雄激素，睪丸血睪屏障的重塑就會(huì)收到阻礙[18].因此，附睪和睪丸主要依賴于雄激素發(fā)揮功能.然而，隨著對(duì)雌激素的深入研究，發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)雄性動(dòng)物生殖亦有重要作用.研究表明雄性動(dòng)物附睪內(nèi)也能合成雌激素并且有CYP19基因表達(dá)[19].通過CYP19基因編碼的P450arom，雄激素被不可逆的轉(zhuǎn)化為雌激素，雌激素通過不同的受體途徑及非經(jīng)典信號(hào)通路發(fā)揮作用，對(duì)雄性生殖具有重要作用.因此，研究P450arom蛋白在附睪中的分布和表達(dá)具有重要意義.

本試驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)CYP19在睪丸和附睪頭、體、尾中均有分布表達(dá).在睪丸中主要分布睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞；附睪中主要分布在附睪上皮細(xì)胞和部分基底細(xì)胞中在這與馬和黃鼠的睪丸和附睪中研究相一致[20-21].這一結(jié)果提示牦牛睪丸和附睪有存在合成雌激素的基礎(chǔ)，且在牦牛睪丸及附睪中可能發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用.

P450arom不可逆的將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYP19mRNA和蛋白在牦牛睪丸及附睪頭、體、尾中均有表達(dá)，mRNA水平在睪丸中表達(dá)最高，隨著附睪尾、頭、體依次減弱；蛋白水平在附睪頭表達(dá)最高，睪丸、附睪體和附睪尾依次增高.研究表明，在麝鼠中附睪尾部P450arom表達(dá)量最高[22]，此外P450arom在小鼠睪丸生殖細(xì)胞中也有表達(dá)[23]，這和本試驗(yàn)結(jié)果相似，說明CYP19在睪丸和附睪中發(fā)揮著重要作用，可能參與調(diào)控精子發(fā)生、精子成熟和精子儲(chǔ)存.此外，Gunapala等[24]研究表明，雌激素有助于精子發(fā)生，Porter等[25]發(fā)現(xiàn)雌激素有助于修復(fù)精子損傷，Carreau等[26]研究發(fā)現(xiàn)，外源性低劑量雌激素可以減少精原細(xì)胞凋亡，刺激睪丸精子發(fā)生.然而，過量的雌激素抑制睪丸及附睪發(fā)育[27].這表明雌激素在精子發(fā)生過程扮演著多重角色.雌激素具有抗炎和抗氧化作用[28].適量的外源雌激素可能與保護(hù)精子免受氧化、炎癥損傷有關(guān)[29].健康男性精液中雌激素含量顯著高于異常組[30].本試驗(yàn)證實(shí)牦牛睪丸和附睪尾中CYP19高表達(dá)，這為附睪存在高濃度雌激素存在了可能，并為其儲(chǔ)存提供有利的微環(huán)境.然而，本研究中CYP19mRNA和蛋白在睪丸和附睪中的表達(dá)結(jié)果不一致，這可能是基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平存在時(shí)空間隔造成的[31].

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究通過研究牦牛的睪丸及附睪頭、體、尾4個(gè)部位的CYP19基因的分布和表達(dá)，發(fā)現(xiàn)各部位均有表達(dá)且存在差異，表明這些部位都有合成雌激素的能力.這些結(jié)果提示雌激素對(duì)雄性牦牛睪丸及附睪的發(fā)育有重要意義，為后續(xù)牦牛繁殖調(diào)控研究提供了一定的基礎(chǔ).