芪衛(wèi)顆粒調(diào)控miRNA-155減輕高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究

王曉磊 高彥彬 張濤靜

足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)腎纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。轉(zhuǎn)分化作為足細(xì)胞損傷的一種重要形式，在與足細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。在慢性高血糖等持續(xù)刺激下，足細(xì)胞將失去自身成熟細(xì)胞的細(xì)胞表型標(biāo)志物(如nephrin)，而間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的表達(dá)增多[1-2]。獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型后的足細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，并能夠產(chǎn)生不必要的膠原等纖維蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155是腎纖維化的主要致病因子之一，在腎纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。筆者研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥芪衛(wèi)顆粒能改善DKD足細(xì)胞損傷，起到延緩腎纖維化進(jìn)展的作用，但其相關(guān)機(jī)制尚不清楚[5]。因此，本研究將在以往研究的基礎(chǔ)上，以miRNA-155為切入點(diǎn)，采用體外實(shí)驗(yàn)觀察芪衛(wèi)顆粒對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及miRNA-155的影響，部分闡明芪衛(wèi)顆粒改善足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

小鼠腎足細(xì)胞株(MCP5)購自北納生物(貨號(hào)：BNCC337685)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑

芪衛(wèi)顆粒(藥物組成：黃芪、鬼箭羽、生地黃、大黃、莪術(shù)，質(zhì)量比例為3∶3∶3∶2∶2)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室制備。

DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibio公司，兔源多克隆nephrin抗體購自美國Novus Biologicals公司(貨號(hào)：NBP1-77303)，兔源多克隆α-SMA抗體購自美國Abcam公司(貨號(hào)：ab5694)，miRNA-155 inhibitor試劑盒套裝購自廣州銳博生物(貨號(hào)：miR20000165-1-5)，CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物(貨號(hào)：KGA317)。

1.3 含藥血清的制備

選取雄性SPF級SD大鼠20只(體重為180±20 g)，隨機(jī)分為芪衛(wèi)顆粒組和空白對照組(分別用于制備含藥血清及空白血清)2個(gè)組，每組10只。其中芪衛(wèi)顆粒組大鼠予芪衛(wèi)顆粒生藥量20 g/(kg·d)灌胃(依照前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量[6])，空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃，每天一次，連續(xù)灌胃7天，于第7天灌胃結(jié)束后2小時(shí)經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血，每只大鼠取血量8～10 mL，室溫靜置并離心取血清，經(jīng)56℃水浴滅活后于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 足細(xì)胞培養(yǎng)及分組

在含5%的CO2培養(yǎng)箱中用DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及10 U/mL γ-干擾素)培養(yǎng)足細(xì)胞，33 ℃環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，37 ℃環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞分化(不含γ-干擾素)。將處于對數(shù)期分化成熟的足細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞共分為4個(gè)組：正常組，高糖組，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組。其中正常組予2.5%空白血清+DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組予2.5%空白血清+DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為30 mmol/L，下同)培養(yǎng)，芪衛(wèi)顆粒組予2.5%含藥血清+DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，miRNA-155基因敲減組先予miRNA-155 inhibitor轉(zhuǎn)染足細(xì)胞敲減miRNA-155(具體操作依照miRNA-155 inhibitor試劑盒說明書)，再予2.5%空白血清+DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細(xì)胞干預(yù)48小時(shí)，隨后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.5 觀察指標(biāo)及采用的檢測方法

CCK-8方法檢測各組細(xì)胞活力。將足細(xì)胞接種至96孔板中，每孔體積100微升，同時(shí)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，按上述分組培養(yǎng)24小時(shí)后加入10微升 CCK-8反應(yīng)液，于37 ℃烘箱反應(yīng)1小時(shí)后，采用酶標(biāo)儀檢測波長為450 納米的OD值并計(jì)算細(xì)胞活力(實(shí)驗(yàn)組OD值/正常組OD值×100 %)，同樣方法依次檢測培養(yǎng)48小時(shí)及72小時(shí)的細(xì)胞活力值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time PCR， RT-PCR)方法檢測足細(xì)胞nephrin基因、α-SMA基因和miRNA-155基因的表達(dá)水平。提取各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄并上機(jī)后，根據(jù)得到的熒光信號(hào)計(jì)算Ct值及基因的相對表達(dá)量。Nephrin基因和α-SMA基因以GAPDH基因作為對照基因，miRNA-155基因以U6基因作為對照基因，每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。檢測指標(biāo)引物序列見表1。

表1 足細(xì)胞檢測相關(guān)指標(biāo)引物序列

蛋白質(zhì)印跡法檢測足細(xì)胞nephrin蛋白及α-SMA的蛋白表達(dá)水平。提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒進(jìn)行濃度測定后，對蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉等處理，隨后4℃環(huán)境中孵育一抗過夜，第二天37℃環(huán)境中封閉1小時(shí)，并孵育二抗，最后經(jīng)顯影獲得目的條帶，并分析蛋白相對表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次。一抗稀釋比例為：nephrin(1∶1000)，α-SMA(1∶1000)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對細(xì)胞活力的影響

不同組別足細(xì)胞干預(yù)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的OD值結(jié)果如表2所示：隨著時(shí)間延長，各組細(xì)胞的OD值呈下降趨勢。在同一孵育時(shí)間里，高糖組足細(xì)胞OD值較正常組明顯下降(P<0.05)，而與高糖組相比，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組足細(xì)胞OD值有所增加(P<0.05)。提示高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著下降，經(jīng)芪衛(wèi)顆粒干預(yù)或敲減miRNA-155處理后細(xì)胞活力能明顯升高。72小時(shí)正常組足細(xì)胞OD值較24小時(shí)組及48小時(shí)組有明顯下降，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用48小時(shí)組。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組足細(xì)胞OD值的比較

2.2 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化基因表達(dá)相關(guān)指標(biāo)的影響

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)nephrin基因和α-SMA基因的表達(dá)水平，結(jié)果如表3所示：與正常組足細(xì)胞相比，高糖組細(xì)胞nephrin的基因表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，而α-SMA的基因表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與高糖組細(xì)胞相比，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組足細(xì)胞nephrin的基因表達(dá)水平明顯有所上調(diào)(P<0.05)，而α-SMA的基因表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。

表3 各組足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)的基因相對表達(dá)水平比較

2.3 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化蛋白表達(dá)相關(guān)指標(biāo)的影響

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)分化蛋白表達(dá)相關(guān)指標(biāo)nephrin蛋白和α-SMA蛋白的結(jié)果如表4所示：相較于正常組足細(xì)胞，高糖組細(xì)胞nephrin的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，α-SMA的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；而與高糖組相比，芪衛(wèi)顆粒組和miRNA-155基因敲減組足細(xì)胞nephrin的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，α-SMA的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。

表4 各組足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)的蛋白相對表達(dá)水平比較

2.4 芪衛(wèi)顆粒含藥血清對足細(xì)胞miRNA-155基因表達(dá)的影響

各組細(xì)胞干預(yù)48小時(shí)后，miRNA-155的基因表達(dá)水平結(jié)果如表5所示：與正常組細(xì)胞相比，高糖組細(xì)胞miRNA-155的基因表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；而與高糖組相比，芪衛(wèi)顆粒組細(xì)胞miRNA-155的基因表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，miRNA-155基因敲減組足細(xì)胞中miRNA-155的基因表達(dá)水平處于較低表達(dá)水平。

表5 各組足細(xì)胞中miRNA-155基因的相對表達(dá)水平比較

3 討論

足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致DKD發(fā)生發(fā)展的重要因素，其損傷形式包括細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞肥大、細(xì)胞凋亡等，其中轉(zhuǎn)分化可于足細(xì)胞損傷早期出現(xiàn)，因此，早期抑制轉(zhuǎn)分化，阻止足細(xì)胞發(fā)生脫落及凋亡，對于延緩DKD的病程進(jìn)展起著重要作用[1]。

miRNA是一類長度為22～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，通過特異性結(jié)合靶基因的3′-UTR發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在DKD足細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用。如抑制miRNA-21的表達(dá)水平可以可以減輕DKD大鼠炎癥反應(yīng)，其機(jī)制是通過提高靶向基因TIMP3的表達(dá)水平來減輕足細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[8]；抑制miRNA-217的表達(dá)能減輕高糖環(huán)境介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和胰島素抵抗，其機(jī)制是通過上調(diào)miRNA-27靶基因PTEN的表達(dá)水平來增強(qiáng)自噬水平實(shí)現(xiàn)的[9]；miR-377通過與長鏈非編碼RNA TUG1內(nèi)源性競爭結(jié)合靶基因PPARγ來促進(jìn)DKD小鼠外基質(zhì)積聚，促進(jìn)DKD病程進(jìn)展，增加長鏈非編碼RNA TUG1的表達(dá)或者抑制miRNA-377的表達(dá)可以抑制DKD病程進(jìn)展[10]。新近的一些研究表明在DKD中，miRNAs參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，如miRNA-21通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化加重DKD腎纖維化進(jìn)展[11]，而miRNA-93通過抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化延緩DKD腎纖維化進(jìn)程[12]等。先前研究發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-155可以改善TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[13]，但miRNA-155是否參與足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化仍未可知。

基于中醫(yī)絡(luò)病理論，筆者認(rèn)為腎絡(luò)的病變是貫穿于DKD始終的病理基礎(chǔ)，本病的病機(jī)早期以氣陰兩虛、腎絡(luò)瘀滯為主[14]。芪衛(wèi)顆粒是根據(jù)該病機(jī)研制的中藥新藥，其功效是益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡(luò)。前期臨床研究表明芪衛(wèi)顆粒能明顯降低早期DKD患者的尿蛋白水平、延緩腎功能[15-16]。該藥的前期基礎(chǔ)研究表明其能夠抑制DKD大鼠腎小球系膜基質(zhì)增生[17]，上調(diào)nephrin蛋白表達(dá)，改善足細(xì)胞足突融合[5]。但其相關(guān)機(jī)制仍需闡明。

筆者團(tuán)隊(duì)在前期工作基礎(chǔ)上，提出并驗(yàn)證了如下設(shè)想：芪衛(wèi)顆粒可以通過調(diào)控足細(xì)胞miRNA-155的表達(dá)水平來改善足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究采用高糖刺激構(gòu)建足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型，以miRNA-155為研究切入點(diǎn)，觀察芪衛(wèi)顆粒對足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和miRNA-155的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下足細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)水平明顯升高，轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)nephrin的基因及蛋白表達(dá)水平明顯下降，α-SMA基因及蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示高糖促進(jìn)了足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。經(jīng)藥物干預(yù)后，足細(xì)胞nephrin的蛋白和基因表達(dá)水平明顯升高，α-SMA的基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低，且細(xì)胞活力明顯升高，提示中藥芪衛(wèi)顆粒能夠抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。miRNA-155基因敲減組足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化水平亦有所減輕(nephrin的表達(dá)水平明顯升高，α-SMA的表達(dá)水平明顯降低)，提示抑制miRNA-155的表達(dá)能改善足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。另外，與高糖組相比較，芪衛(wèi)顆粒干預(yù)后的足細(xì)胞miRNA-155的表達(dá)水平明顯下降，提示芪衛(wèi)顆粒能抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)水平。芪衛(wèi)顆粒對高糖環(huán)境下足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用效果與敲減miRNA-155的作用效果相似，故認(rèn)為芪衛(wèi)顆粒可以通過抑制miRNA-155減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。但miR-155是否通過調(diào)控其相關(guān)靶基因表達(dá)水平促進(jìn)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，及芪衛(wèi)顆粒如何抑制足細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)，這些機(jī)制需要進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，芪衛(wèi)顆粒能夠明顯減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其部分機(jī)制是通過抑制miRNA-155的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。