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    脂多糖環(huán)境下銀納米顆粒對人骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化的影響

    2021-07-17 13:32:56趙忠福李曉光鄒德勛孫蘭春姚宏波
    中國醫(yī)療器械信息 2021年12期
    關鍵詞:茜素抗人成骨

    趙忠福 李曉光 鄒德勛 孫蘭春 姚宏波

    1 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院骨外科 (黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    2 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心內科 (黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    3 齊齊哈爾醫(yī)學院基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室 (黑龍江 齊齊哈爾 161006)

    內容提要:目的:闡明細胞炎癥環(huán)境下,銀納米顆粒(AgNP)對人骨髓間充質干細胞(BMSC)增殖和成骨分化的影響及作用機制。方法:150μg/L脂多糖(LPS)建立細胞炎癥模型。在細胞炎癥模型條件下BMSC分為:炎癥對照組、炎癥AgNP組和炎癥Akt抑制劑組。正常環(huán)境下BSMC分為正常對照組和正常AgNP組。各組BMSC均進行21d成骨誘導。再分別以MTT、Western blot檢測各組BMSC增殖吸光度值(A值)和Caspase 3蛋白的表達;ELISA或Western blot檢測各組BMSCs的骨形成蛋白-2(BMP-2)、堿性磷酸酶(ALP)含量或相對表達水平;ELISA檢測各組BMSCs的總超氧化物歧化酶(Total-SOD)和丙二醛(MDA)含量;各組BMSCs均進行茜素紅染色,計算光密度值(OD值)。結果:相對于正常對照組,正常AgNP組BMSCs的A值明顯升高(P<0.01);Caspase 3蛋白表達降低(P<0.01);正常AgNP組BMSCs的BMP-2、ALP、Total-SOD蛋白表達或茜素紅染色OD值均明顯增加(P<0.01),正常AgNP組MDA表達顯著降低(P<0.01)。與炎癥對照組相比,炎癥AgNP組BMSCs的A值明顯提高(P<0.01);Caspase 3蛋白表達顯著降低(P<0.01);炎癥AgNP組BMP-2、ALP、Total-SOD表達或茜素紅染色OD值均明顯增加(P<0.01),MDA表達顯著降低(P<0.01)。炎癥Akt抑制劑組的BMP-2、ALP、Total-SOD、MDA表達相對于炎癥AgNP組均呈相反趨勢。結論:細胞炎癥環(huán)境下,銀納米顆粒通過Akt信號通路提高Total-SOD等抗氧化酶的表達,促進BMSCs增殖和成骨分化。

    據報道,骨關節(jié)假體、支架材料等骨科植入物感染發(fā)生率至少5.0%[1,2],骨植入物感染不僅給患者帶來嚴重后果,而且產生高昂的經濟負擔[3]。雖然在關節(jié)假體或骨植入物中添加慶大霉素、萬古霉素等抗生素[4],但是抗生素嚴重的副作用和細菌耐藥性持續(xù)加劇,生物材料感染率一直居高不下[1,2]。因此,必須建立針對此類生物的充分預防措施。

    銀已被用作抗菌劑已有數(shù)百年歷史。銀納米顆粒(Silver nanoparticles,AgNP)穩(wěn)定釋放銀離子。由于Ag2+優(yōu)選結合至硫、磷等電子供體基團,因此,AgNP能夠與電子傳輸鏈中的含硫代謝酶或與富含磷的DNA相互作用,從而抑制微生物產生或傳遞能量過程[5]。研究發(fā)現(xiàn),AgNP具有抑制革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌、真菌和病毒等廣譜抗菌活性[6],AgNP可被應用于生物材料合成、醫(yī)用材料涂層等領域[7]。

    骨髓內含有大量骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC),BMSC能夠分化為骨或軟骨,BMSCs尚能分化為成骨細胞(Osteoblasts),參與促進骨組織修復和骨折愈合的過程,是硬組織工程研究重要的“種子細胞”[8]。評估細胞炎癥環(huán)境下,AgNP對BMSC增殖、凋亡和成骨分化的影響效果和機制,擴展銀納米顆粒在臨床應用提供理論依據。

    1.資料與方法

    1.1 細胞

    hBMSCs購自廣州賽業(yè)生物公司。

    1.2 主要試劑和儀器

    α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液(Hyclone公司);10nm銀納米溶液、噻唑藍(MTT)、脂多糖(LPS)、二甲基亞砜、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C(Sigma-Aldrich公司);Triciribine(Selleck公司);RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒等Western blot試劑(碧云天生物科技公司);茜素紅染色試劑盒(南京建成試劑公司),人BMP-2、ALP、Total-SOD和MDA的ELISA試劑盒(R&D公司);小鼠抗人Caspase 3抗體、小鼠抗人BMP-2抗體、小鼠抗人ALP抗體、小鼠抗人GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(Abcam公司),增強化學發(fā)光劑(Invitrogen公司)。Spectra Max190酶標儀(Molecular Devices公司);FACSAria II流式細胞儀(BD公司);IX53型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)。Tanon 6200發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組。含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基為BMSC基礎培養(yǎng)基。BMSC基礎培養(yǎng)基含10mmol/L β-甘油磷酸鈉、100μmmol/L地塞米松、0.1mmol/L維生素C則為BMSC成骨培養(yǎng)基。以150μg/L脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立細胞炎癥模型。在細胞炎癥模型下培養(yǎng)的BMSCs為炎癥對照組,以5μmol/L AgNP刺激BMSC則為炎癥AgNP組,若添加5μmol/L AgNP和5nmol/L Triciribine則為炎癥Akt抑制劑組。正常培養(yǎng)條件下,無任何刺激培養(yǎng)的BMSCs為正常對照組,以0.01μg/L AgNP處理BMSC則為正常AgNP組。以上各組BMSCs均在37°C,5% CO2下,用BMSC成骨培養(yǎng)基誘導21d。

    1.3.2 MTT實驗檢測BMSC吸光度。0.8×104/孔BMSCs加入96孔細胞培養(yǎng)板中,37°C,5% CO2培養(yǎng)12h;按照實驗分組更換BMSC成骨培養(yǎng)基或不同試劑;每孔內添加5g/L MTT;37°C,5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4h,再加入100μL二甲基亞砜,充分震蕩。Spectra Max190酶標儀在490nm波長檢測各組BMSC的吸光度值(Absorbance value,A值)。

    1.3.3 Western blot檢測BMSC的Caspase 3、BMP-2、ALP表達。4.0×106各組BMSCs用含1mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液裂解。4°C,12000r/min離心5min,35μg各組BMSCs蛋白經10% SDS-PAGE電泳90min,轉至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉60min;分別加入小鼠抗人Caspase 3抗體(1:550)、小鼠抗人BMP-2抗體(1:350)、小鼠抗人ALP抗體(1:500)、小鼠抗人GAPDH抗體(1:800),4°C過夜;加入HRP標記山羊抗小鼠IgG(1:700),室溫孵育60min;增強化學發(fā)光劑顯示蛋白條帶,Tanon 6200發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影。

    1.3.4 茜素紅染色檢測BMSC的成骨分化。1.0×106各組BMSCs成骨誘導21d后,0.01mmol/L PBS沖洗3次,每次1min;4%多聚甲醛固定60min,1%茜素紅染色60min,0.01mmol/L PBS漂洗3次,每次1min;IX53顯微鏡觀察各組BMSCs鈣化結晶的染色效果,Image-Pro Plus 6.0.1圖像軟件分析各組BMSCs的茜素紅染色光密度值(Optical density value,OD)。

    1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測Total-SOD、MDA蛋白含量。4.0×106各組BMSCs在37°C,5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)12h,0.01mmol/L PBS清洗3次,每次1min;RIPA裂解液裂解。4°C,10000r/min離心5min,取上清液,人ELISA試劑盒檢測各組BMSCs的Total-SOD、MDA含量[9]。

    1.4 統(tǒng)計學分析

    實驗數(shù)據采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計與分析,計量資料以±s表示,組間比較采用方差分析,兩組間比較采用Q檢驗,P<0.05為差異有顯著性意義。

    2.結果

    2.1 AgNP對BMSCs增殖的影響

    見圖1。

    圖1 各組BMSCs的增殖A值比較(±s,n=15)

    2.2 AgNP抑制Caspase 3蛋白表達

    見圖2。

    圖2 Western blot檢測各組BMSCs的Caspase 3蛋白表達(±s,n=15)

    2.3 AgNP促進BMSC茜素紅染色光密度值表達

    為了闡明AgNP對BMSC成骨分化的影響,茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn):茜素紅染色的形態(tài)學實驗提示AgNP能夠促進BMSC分化為成骨細胞(圖3)。

    圖3 各組BMSC的茜素紅染色(×100,±s,n=30)

    2.4 AgNP對BMP-2、ALP蛋白表達的影響

    為了進一步驗證AgNP對BMSC成骨分化的影響,首先檢測成骨特異性蛋白BMP-2、ALP含量(見表1)。接下來,Western blot檢測BMP-2、ALP相對表達情況(圖4)。兩種實驗均證明AgNP促進BMSC分化為成骨細胞,這種促進BMSC分化的作用可被Akt抑制劑阻斷。

    表1 各組BMSCs的BMP-2、ALP含量(±s,n=25)

    表1 各組BMSCs的BMP-2、ALP含量(±s,n=25)

    注:aP<0.01、bP<0.01,與正常對照組比較;cP<0.01、dP<0.01,與正常對照組比較;eP<0.01、fP<0.01,與炎癥對照組比較;gP<0.01、hP<0.01,與炎癥AgNP組比較。

    images/BZ_6_1287_1994_2302_2255.png組別 BMP-2(μg/mL) ALP(U/mL)正常對照組 6.751±0.241 7.517±0.455 P P=0.0000 P=0.0000

    表2 各組BMSCs的Total-SOD和MDA表達(±s,n=25)

    表2 各組BMSCs的Total-SOD和MDA表達(±s,n=25)

    注:aP<0.01、bP<0.01,與正常對照組比較;cP<0.01、dP<0.01,與正常對照組比較;eP<0.01、fP<0.01,與炎癥對照組比較;gP<0.01、hP<0.01,與炎癥AgNP組比較。

    images/BZ_50_214_1072_1228_1321.png組別 Total-SOD(U/mL) MDA(μg/mL)正常對照組 85.068±1.542 7.095±0.518 P P=0.0000 P=0.0000

    圖4 各組BMSC的BMP-2、ALP蛋白表達(±s,n=30)

    2.5 AgNP對Total-SOD、MDA蛋白表達的影響

    為了進一步驗證AgNP對BMSC影響的分子機制,檢測Total-SOD、MDA氧化酶的表達。結果提示AgNPC能夠促進BMSC表達Total-SOD,抑制MDA蛋白表達。

    3.討論

    銀作為非特異性殺菌劑,在治療感染的起著重要作用[10]。銀納米顆粒(AgNP)大小是影響其抗菌活性水平的重要因素[11]。研究顯示,直徑10nm的AgNP有較大的表面積釋放銀離子,殺菌或抑菌效果更顯著,因此本實驗選擇粒徑10nm的AgNP為研究對象。

    在細胞炎癥模型下,相對于炎癥對照組,炎癥AgNP組的BMSC增殖A值顯著提高,說明AgNP能夠促進BMSC的增殖活性,其原因可能是由于AgNP具有較好的抗氧化、抑菌,能夠提高細胞內抗氧化酶的表達[12]。炎癥AgNP組的Caspase 3蛋白表達降低也間接驗證了AgNP對BMSC具有抗氧化,抑制自由基活性的功能[13]。為了驗證我們的分析,本實驗以ELISA實驗證明了炎癥AgNP組Total-SOD蛋白高表達,使BMSC能夠對抗炎癥造成的高自由基環(huán)境。

    本實驗利用ELISA實驗發(fā)現(xiàn):與炎癥對照組相比,炎癥AgNP組MDA表達水平下降,再次表明AgNP在抗自由基損傷中起著重要作用。實驗發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,正常AgNP組BMSC的成骨細胞特異性BMP-2、ALP蛋白含量均顯著高表達;細胞炎癥環(huán)境下,相對于炎癥對照組,炎癥AgNP組BMSC的BMP-2、ALP蛋白含量均呈現(xiàn)升高趨勢,這說明正常或細胞炎癥環(huán)境下,AgNP均能夠促進BMSC成骨分化。與炎癥AgNP組相比,炎癥Akt抑制劑組BMSC的BMP-2、ALP蛋白含量呈低表達,這些研究結果說明BMSC在AgNP的作用下具有較好的成骨分化能力。

    綜上所述,細胞炎癥環(huán)境下,AgNP激活抗氧化酶,促進BMSC增殖和成骨分化,對提高BMSC抗炎反應,加速骨修復具有較好效果。

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