GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌中的表達及與預后的關系*

王科峰,崔 喆,曹景愷,王曉輝

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院寶山分院/上海市寶山區(qū)大場醫(yī)院普外科，上海 200444; 2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院普外科，上海 200120

直腸癌是消化道常見腫瘤之一，發(fā)生于乙狀結腸與直腸交界處至齒狀線之間，臨床多行根治性手術切除以改善患者預后。晚期直腸癌患者由于病情惡化，腫瘤細胞發(fā)生轉移、侵襲等，預后情況往往較早期患者差。谷胱甘肽過氧化物酶2(GPX2)又稱為胃腸特異性谷胱甘肽過氧化酶，是一種含硒蛋白，主要表達于胃腸道系統(tǒng)，具有抗炎抗氧化損傷的作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GPX2在多種腫瘤中高表達，尤其是炎癥誘發(fā)的腫瘤中，可能起到促進細胞增殖、抑制凋亡等作用[2-3]。關于GPX2在直腸癌中的表達關系近年來國內(nèi)外少見報道。核因子E2相關因子2(Nrf2)結構中包含亮氨酸拉鏈，在調(diào)節(jié)細胞氧化還原中發(fā)揮重要作用[4-5]。早期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中Hmox1/Nrf2 mRNA水平的比值可能作為大腸癌遠處轉移的預測因子，提示Nrf2基因可能參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展[6]。而Nrf2蛋白在直腸癌中的表達情況不甚明確。基于此，本研究通過檢測直腸癌患者腫瘤組織中GPX2、Nrf2蛋白表達情況，分析其不同表達水平與患者生存的關系，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年6月于上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院及上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院寶山分院腫瘤科行手術切除治療的直腸癌患者病理組織標本80份，以術中所取癌旁(距腫瘤病灶>5 cm)正常直腸黏膜組織標本57份為對照，所有組織標本均用4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，采用石蠟包埋。納入標準：(1)接受根治術治療；(2)術前未接受放、化療或其他抗腫瘤藥物治療；(3)臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤患者；(2)合并急慢性感染性疾病者；(3)合并免疫系統(tǒng)疾病患者。所有患者及家屬均自愿簽署知情同意書，本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2數(shù)據(jù)庫分析 Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個可全面分析癌癥組學的網(wǎng)站，其中TCGA數(shù)據(jù)庫可實現(xiàn)相關基因/靶標分析和可視化。基于該數(shù)據(jù)庫，本研究分析GPX2、Nrf2基因在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的表達。

1.3方法 使用兔抗人多克隆抗體GPX2(美國Sigma公司)，一抗工作濃度為1∶500；兔抗人多克隆抗體Nrf2，稀釋濃度為1∶200。將組織以4 μm連續(xù)切片，充分烘烤后采用免疫組化法檢測直腸癌組織和正常直腸黏膜組織GPX2、Nrf2蛋白的表達情況。標本檢測均由檢驗科兩名經(jīng)驗豐富的醫(yī)生進行操作，免疫組化Envision染色法按照試劑盒說明書步驟進行。利用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

用半定量方法對免疫組化結果進行判定。隨機選取5個高倍鏡視野進行染色結果評分，取平均值。評分方法如下，(1)依據(jù)細胞染色強度進行評分：細胞不著色記為0分，淡黃色記1分，黃色或黃棕色記2分，棕褐色或深褐色記3分；(2)依據(jù)陽性細胞所占百分比進行評分：陽性細胞<5%記為0分，陽性細胞占5%～25%記1分，>25%～50%記2分，陽性細胞>50%記3分。將細胞染色強度和陽性細胞所占百分比評分的乘積作為最終得分，若最終得分≥2分，判定為表達陽性(+)，<2分為表達陰性(-)；同時將得分≥3分定義為高表達，<3分定義為低表達。

1.4隨訪觀察 所有患者均進行電話隨訪或門診隨訪，第1～2年每3個月進行一次隨訪，第3年每6個月進行一次隨訪。隨訪時間從術后開始，截止日期為2020年6月，隨訪時間為10～42個月，中位隨訪時間為27個月。分析不同GPX2、Nrf2蛋白表達水平直腸癌患者的生存情況。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)的錄入與分析。計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間生存曲線差異用對數(shù)秩檢驗(Log-Rank test)；多因素Cox回歸分析影響直腸癌患者預后不良的危險因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1GPX2、Nrf2基因在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的表達差異 比較TCGA數(shù)據(jù)庫中166份直腸癌組織標本和10份正常直腸黏膜組織標本中GPX2、Nrf2基因的表達水平，結果顯示，GPX2基因在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Nrf2基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的免疫組化結果 免疫組化結果顯示，GPX2、Nrf2蛋白主要定位于直腸癌組織細胞的細胞質和細胞膜，見圖1。GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織中的陽性表達率分別為67.50%(54/80)、76.25%(61/80)，明顯高于正常直腸黏膜組織中的24.56%(14/57)、31.58%(18/57)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織和正常直腸黏膜組織中的陽性表達情況[n(%)]

2.3直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達相關性 GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌組織中共表達陽性46例，共表達陰性11例，二者表達存在相關性(χ2=7.325，P<0.05)。見表2。

表2 直腸癌組織中GPX2、Nrf2表達相關性(n)

2.4直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達情況與患者特征之間的關系 GPX2、Nrf2蛋白表達情況在不同年齡、性別、腫瘤大小直腸癌患者之間，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在不同腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移直腸癌患者之間，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達情況與患者特征之間的關系(n)

續(xù)表3 直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白表達情況與患者特征之間的關系(n)

注：A表示GPX2在直腸癌組織中高表達；B表示GPX2在正常直腸黏膜組織中低表達；C表示Nrf2在直腸癌組織中高表達；D表示Nrf2在正常直腸黏膜組織中低表達。

2.5GPX2、Nrf2蛋白表達情況與直腸癌患者術后3年生存情況的關系 直腸癌組織中GPX2蛋白高表達組和低表達者3年累積生存率分別為31.92%、45.54%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.429，P=0.035)；Nrf2蛋白高表達者和低表達者3年累積生存率分別為26.93%、51.27%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.822，P=0.009)，見圖2、3。

圖2 GPX2蛋白表達與直腸癌患者3年累積生存率的關系

2.6影響直腸癌患者預后的多因素Cox回歸分析 多因素Cox回歸分析結果顯示，GPX2蛋白高表達、Nrf2蛋白高表達、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移是影響直腸癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

圖3 Nrf2蛋白表達與直腸癌患者3年累積生存率的關系

表4 影響直腸癌患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

GPX2是一種含硒酶，屬于谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)家族，是谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的關鍵酶。目前已知GPX家族有8個亞型(GPX1～GPX8)，其中在人類中表達的有5種，分別為GPX1、GPX2、GPX3、GPX4、GPX6，且均是含硒蛋白[7-8]。研究表明，硒具有抗氧化、抗衰老、提高機體免疫力和預防地方性疾病等作用，硒主要以硒蛋白的方式發(fā)揮生物學功能，因此，GPX2在抗氧化損傷、抗炎等方面的研究已較為普遍[9-10]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)GPX2在腫瘤中也發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，利用硒增強飼糧喂養(yǎng)慢性結腸炎小鼠可增加結腸組織中GPX2表達，從而降低氧化應激作用，使小鼠免于罹患慢性炎癥引起的結腸癌[11]。EMMINK等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GPX2沉默可導致結直腸癌細胞中自由基氧的積累，增加細胞凋亡，降低克隆形成和轉移能力，而GPX2過表達則有利于細胞對自由基氧的清除，有利于細胞增殖和腫瘤生長，促進克隆形成和轉移能力。本研究免疫組化結果顯示，GPX2蛋白在直腸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常直腸黏膜組織，與TCGA數(shù)據(jù)庫中GPX2基因表達趨勢一致；進一步分析直腸癌患者特征發(fā)現(xiàn)，GPX2蛋白表達水平在不同腫瘤分化程度、不同TNM分期、是否有淋巴結轉移的直腸癌患者之間，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示GPX2蛋白高表達與腫瘤惡性進展有關，推測GPX2蛋白高表達可能有利于腫瘤細胞應對氧化應激，使得直腸癌細胞增殖、遷移侵襲能力增強，從而促進疾病發(fā)展。生存分析結果顯示，GPX2蛋白高表達患者3年累積生存率與GPX2蛋白低表達患者相比明顯降低，提示GPX2蛋白高表達與直腸癌患者預后不良有關。另外，有學者發(fā)現(xiàn)GPX2通過Wnt通路介導腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[13]，然而該通路是否在直腸癌中發(fā)揮調(diào)控作用有待進一步細胞實驗研究。

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)家族，作為轉錄因子可調(diào)控抗氧化應激反應元件(ARE)、GPX2等抗氧化蛋白的表達[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2結構中包含7個高度保守的多肽域，其中Neh2是與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)結合的結構域[15]。研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞中Nrf2的異常激活是通過Keap1或Nrf2基因的體細胞突變及其他破壞Keap1與Nrf2結合的機制發(fā)生的[16]。Nrf2是細胞抗氧化反應的主要調(diào)節(jié)因子，已有研究證實正常細胞中Nrf2缺失所致氧化應激過分激活可導致DNA損傷突變，增加腫瘤發(fā)生及惡化風險[17]，然而Nrf2蛋白在腫瘤中表達上調(diào)，亦可提高癌細胞的抗氧化和解毒能力，賦予腫瘤細胞快速增殖生長、轉移、侵襲等致癌活性，對荷瘤宿主產(chǎn)生不利影響[18-19]。國內(nèi)學者靳倩倩等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁組織，且Ⅲ～Ⅳ期患者Nrf2蛋白陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期，說明Nrf2蛋白參與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究免疫組化結果顯示，Nrf2蛋白在直腸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常直腸黏膜組織，與TCGA數(shù)據(jù)庫中趨勢不一致，可能是因為基因與蛋白水平存在一定差異。另外，Nrf2蛋白表達水平與直腸癌患者腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移有關，提示Nrf2蛋白可能通過調(diào)控腫瘤細胞氧化應激及炎癥作用影響癌癥發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織中GPX2與Nrf2蛋白表達具有一定的相關性，提示GPX2、Nrf2蛋白在直腸癌可能共同作用參與調(diào)控直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，Nrf2蛋白可調(diào)控GPX2蛋白表達，二者在直腸癌中的具體作用機制有待進一步研究。生存分析結果顯示，Nrf2高表達患者3年累積生存率明顯低于低表達患者，表明Nrf2蛋白與直腸癌患者預后不良有關。進一步Cox回歸分析結果顯示，GPX2蛋白高表達、Nrf2蛋白高表達、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結轉移是影響直腸癌患者預后的獨立危險因素，提示GPX2蛋白高表達、Nrf2蛋白高表達患者預后不良風險增高，GPX2、Nrf2蛋白可能成為臨床治療直腸癌的潛在靶點。

綜上所述，直腸癌組織中GPX2、Nrf2蛋白呈高表達，GPX2、Nrf2蛋白高表達患者3年累積生存率較低表達患者短，進一步研究發(fā)現(xiàn)，GPX2與Nrf2蛋白水平有一定相關性，推測Nrf2可能調(diào)控GPX2表達，共同通過氧化應激途徑影響直腸癌的發(fā)展，進而影響患者預后，然而具體作用機制有待更深入研究。