TRPA1 抑制劑的高通量篩選及新型骨架的發(fā)現(xiàn)

丁強

（上海璃道醫(yī)藥科技有限公司，上海 201114）

TRPA1 是瞬時受體電位通道超家族中的一員[1]，作為一種非選擇性陽離子通道，可通透Na+，K+和Ca2+等[2]。TRPA1 主要分布在背根神經(jīng)、三叉神經(jīng)等初級感覺神經(jīng)元上，且在肽能和非肽能神經(jīng)元均有表達[3]。從分布的人體系統(tǒng)來看，TRPA1 高表達在外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)[4]，當(dāng)這些器官組織出現(xiàn)功能異常時，TRPA1 通道的表達和功能通常也同步發(fā)生異常。TRPA1 可感受多種不同類型的刺激，如低溫、內(nèi)/外源性化合物和機械性刺激等[5，6]，并參與機體的炎癥和免疫反應(yīng)[7]?；?qū)W證據(jù)表明TRPA1 發(fā)生基因突變可導(dǎo)致人類疼痛[8]，且藥理學(xué)實驗也證明TRPA1 通道的抑制劑可在多種不同的疼痛模型上有效鎮(zhèn)痛[9，10]。此外，TRPA1 激活還可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)障礙[11]，如咳嗽、哮喘和慢性阻塞性肺病[12，13]。

TRPA1 作為確定的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳新靶點，近年來國際上各大制藥公司都在圍繞TRPA1 通道進行創(chuàng)新藥物研發(fā)和布局，但尚無小分子被批準(zhǔn)上市[14]。黃嘌呤衍生物HC030031 是TRPA1 的經(jīng)典抑制劑，在小鼠模型中通過靜脈注射可以緩解緩激肽引起的觸覺異常痛敏，口服可減輕異硫氰酸烯丙酯（AITC）誘導(dǎo)的疼痛，在炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎活性[15]；霧化吸入可以減輕豚鼠模型中丙烯醛或者肉桂醛引起的咳嗽，同樣對哮喘模型也有效[16]。GRC-17536 是格倫馬克推進到臨床2 期的TRPA1 抑制劑，適應(yīng)癥為糖尿病性周圍神經(jīng)痛和呼吸系統(tǒng)疾病[17]。該分子已經(jīng)在捷克、德國和英國等國家完成概念性驗證實驗，效果顯著，且無明顯副作用，目前還在積極推動中。除此之外，禮來、羅氏、雅培、安進、諾華和阿斯利康等均布局了TRPA1 抑制劑的專利[18]。面對這一國際研發(fā)新趨勢，國內(nèi)尚缺乏靶向TRPA1 通道的藥物研發(fā)管線，顯著落后于國際研發(fā)進度。

本研究利用自動化高通量篩選系統(tǒng)和手動膜片鉗檢測技術(shù)，靶向TRPA1 通道，對自建的已上市藥物樣品庫進行抑制活性篩選，發(fā)現(xiàn)多種不同特性的三環(huán)類分子具有明顯的TRPA1 抑制活性，且結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。在已報道的TRPA1 抑制劑中，還沒有三環(huán)類骨架，本研究將為TRPA1 抑制劑的藥物研發(fā)提供新的骨架結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 試劑

AITC 購自Sigma；HC030031 由Biobond 制藥公司合成；酮替芬和苯噻啶蘋果酸酯購自九鼎化學(xué)；米安色林和米氮平購自畢得醫(yī)藥；奧氮平購自安耐吉化學(xué)。

細胞培養(yǎng)用的DMEM培養(yǎng)基、滅瘟素、潮霉素B、1%青霉素- 鏈霉素溶液和胎牛血清購自Invitrogen；0.25%胰酶溶液購自Life technologies；強力霉素購自Sigma。

1.2 儀器設(shè)備

細胞培養(yǎng)箱和超凈臺購自Thermo fisher；超低溫冰箱購自浙江和利制冷設(shè)備有限公司；精密電子天平和pH 測量儀購自Sartorius；IonWorks Barracuda 高通量篩選系統(tǒng)購自美國Molecular Devices；Axon700B 手動膜片鉗系統(tǒng)購自美國AXON；電極拉制儀購自美國Sutter；快速程控壓力給藥系統(tǒng)購自法國Bio-Logic。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

將小鼠源TRPA1（mTRPA1）通道的cDNA 全長亞克隆到pcDNATM5/FRT/TO 質(zhì)粒中，整合后的質(zhì)?？寺〉紽lp-InTM-293宿主細胞，使用滅瘟素和潮霉素B 進行壓力篩選，得到穩(wěn)定表達mTRPA1 通道基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

mTRPA1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)基含有90% DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素- 鏈霉素+15μg/mL 滅瘟素+200μg/mL 潮霉素B。細胞置于培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱，待細胞密度達到80%左右進行傳代或鋪板。需要檢測時，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞經(jīng)強力霉素誘導(dǎo)過表達mTRPA1 通道。

1.3.3 手動全細胞膜片鉗檢測

電流記錄采用Axon700B 膜片鉗放大器，信號采集使用pClamp10 軟件，采樣頻率10 kHz，濾波2 kHz，電極電阻2～4 MΩ。細胞鉗制在0 mV，電壓刺激命令是一個-100 mV 到+100 mV 的斜坡電壓，時程300 ms，每2 s 給予一個電壓刺激?；衔锸怯煽焖俪炭貕毫o藥系統(tǒng)給予細胞。外液(mM)：140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.5 EGTA, 10 Glucose (pH 7.4)；內(nèi)液(mM)：140 CsCl, 10 HEPES, 5 EGTA, 0.1 CaCl2, 1 MgCl2(pH 7.2)。

1.3.4 IonWorks Barracuda（IWB）高通量篩選

刺激電壓和內(nèi)外液成分與手動膜片鉗檢測相同，但內(nèi)液中加入0.1 mg/mL 膜穿孔試劑兩性霉素B。在PPC384 孔板中加入細胞外液，PPC 板下加入細胞內(nèi)液，進行封接測試，最后將細胞內(nèi)液換成含兩性霉素B 的細胞內(nèi)液，使封接的細胞穿孔后形成全細胞記錄模式。數(shù)據(jù)記錄和電流幅度測量導(dǎo)出由IWB 軟件完成(version 2.5.3，Molecular Devices Corporation，Union City，CA)。封接阻抗低于20 MΩ 的孔將不納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計。原始電流數(shù)據(jù)由軟件進行漏減矯正，mTRPA1 電流幅度在+100 mV 時測得。

2 結(jié)果

2.1 mTRPA1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建和活性驗證

mTRPA1 的cDNA 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程整合到宿主細胞Flp-InTM-293 的染色體后，經(jīng)過15 μg/mL 滅瘟素和400 μg/mL 潮霉素B 的壓力篩選，得到mTRPA1 基因穩(wěn)定傳代的細胞株。為了確認穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株能否表達有活性的mTRPA1 通道，我們使用1 μg/mL 強力霉素誘導(dǎo)，并應(yīng)用手動膜片鉗進行驗證（圖1）。AITC 和HC030031（HC）分別是TRPA1 通道的經(jīng)典激動劑和抑制劑。檢測結(jié)果顯示，AITC 可誘導(dǎo)出明顯的通道電流，且電流呈現(xiàn)典型的TRPA1 通道特點，即外向整流、可被HC030031抑制和反轉(zhuǎn)電位0 mV。

圖1 手動膜片鉗驗證mTRPA1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的活性

2.2 已上市藥物樣品庫的構(gòu)建及TRPA1 抑制劑的高通量篩選

目前，有許多靶向TRPA1 通道的藥物研發(fā)，但尚無小分子被批準(zhǔn)上市。我們建立了大樣本量的已上市藥物樣品庫，化合物總數(shù)超過2000 個，含有多種不同類型的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其適應(yīng)癥包括胃腸道疾病、老年癡呆、疼痛、尿失禁、抑郁、鎮(zhèn)咳、降血壓、抗組胺、抗過敏、抗精神病和催吐等。我們采用IWB 高通量篩選平臺，結(jié)合mTRPA1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，對已上市藥物樣品庫的mTRPA1 抑制活性進行全面評價。此平臺是基于電流檢測，因此相關(guān)評價更直觀和精確，檢測結(jié)果如圖2 所示，多種化合物均呈現(xiàn)mTRPA1 抑制活性。

圖2 TRPA1 抑制劑的篩選流程和高通量篩選匯總

2.3 具有mTRPA1 抑制活性的三環(huán)類骨架分子

對IWB 高通量篩選得到的具有mTRPA1 抑制活性的化合物進行結(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)在已上市藥物樣品庫中，多個三環(huán)類分子具有明顯的mTRPA1 抑制活性，且結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抑制IC50（μM）如圖3 所示。根據(jù)臨床應(yīng)用，這些三環(huán)類分子分別具有抗抑郁、抗精神病和抗組胺等特性。

圖3 具有mTRPA1 抑制活性的三環(huán)類分子結(jié)構(gòu)

2.4 確證若干三環(huán)類分子的mTRPA1 抑制活性

在IWB 高通量篩選中，米安色林、米氮平、奧氮平、乙酰哌普嗪、酮替芬和苯噻啶蘋果酸酯的抑制活性較強。我們采用手動膜片鉗進一步確認這些三環(huán)類分子的活性，并檢測其劑量效應(yīng)。如圖4 所示，上述三環(huán)類分子在手動膜片鉗系統(tǒng)中的抑制IC50與高通量篩選結(jié)果基本一致，進一步確認了這些三環(huán)類分子的mTRPA1 抑制活性，且驗證了IWB 高通量篩選系統(tǒng)的精確性。

圖4 手動膜片鉗驗證若干三環(huán)類分子的TRPA1 抑制活性

3 討論

TRPA1 作為一種可通透Na+，K+和Ca2+的非選擇性陽離子通道，近年來在藥物研發(fā)領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注，尤其是疼痛。TRPA1 通道是最具潛力的新型鎮(zhèn)痛靶點，主要有以下特點：（1）安全性高：TRPA1 通道主要分布于外周，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中的表達豐度很低[4]，極大降低了其中樞和心臟副作用的風(fēng)險，與其它靶點相比顯示出極大優(yōu)越性，且針對外周靶點開發(fā)鎮(zhèn)痛藥物是當(dāng)前鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的重要趨勢。而且，TRPA1 是人TRPA 亞家族中的唯一成員，減少了通道特異性的風(fēng)險。（2）TRPA1 通道與人疼痛關(guān)系明確：TRPA1 是明確的人疼痛感受器，其基因突變可導(dǎo)致人類疼痛，具有明確的基因?qū)W證據(jù)支持TRPA1 通道，符合藥物靶點的主流理論。（3）已有TRPA1 抑制劑鎮(zhèn)痛效應(yīng)優(yōu)異：目前已有數(shù)個小分子化合物進入了臨床I 期和II 期研究，主要用于治療糖尿病性神經(jīng)痛和急性疼痛，如GRC-17536 和CB-625，且GRC-17536 的鎮(zhèn)痛效應(yīng)已經(jīng)經(jīng)過概念性驗證。此外，許多臨床前動物藥效實驗也證明，TRPA1 抑制劑對多種傷害性疼痛、內(nèi)臟痛、神經(jīng)痛和纖維肌痛均有較好的鎮(zhèn)痛活性，表明TRPA1 靶點存在廣譜的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。同時，TRPA1的功能改變還可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)的異常，因此，TRPA1 靶點的適應(yīng)癥具有廣闊的開發(fā)前景。

國內(nèi)由于缺乏高通量篩選平臺和新型骨架結(jié)構(gòu)，對TRPA1通道靶點的布局與國外相比嚴(yán)重滯后。本研究通過構(gòu)建mTRPA1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株和超過2000 個化合物的已上市藥物樣品庫，利用基于電流檢測的IWB 高通量篩選系統(tǒng)和手動膜片鉗，發(fā)現(xiàn)了眾多具有TRPA1 抑制活性的化合物。通過結(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)一系列具有三環(huán)類骨架的分子均具有明顯的TRPA1 抑制活性，且結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。三環(huán)類分子是臨床上的一類重要藥物，具有抗抑郁、抗組胺、抗精神疾病或抗過敏等活性。有趣的是，臨床上很多三環(huán)類分子還可用于鎮(zhèn)痛，如抗抑郁藥阿米替林可用于纖維肌痛綜合征和糖尿病性周圍神經(jīng)痛的治療，但其確切機制通常并不清晰。本研究可能為臨床上多種三環(huán)類分子拓展鎮(zhèn)痛適應(yīng)癥提供理論基礎(chǔ)。

三環(huán)類骨架作為TRPA1 通道的抑制劑尚未被報道，通過系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系優(yōu)化，可能找到抑制活性更強且具有全新結(jié)構(gòu)類型的TRPA1 抑制劑，并針對TRPA1 的相關(guān)適應(yīng)癥進行生物活性驗證，從而找到合適的候選化合物。本研究的發(fā)現(xiàn)將為國內(nèi)靶向TRPA1 通道進行新藥研發(fā)提供新型骨架分子做出有益探索。