蒽酮-硫酸顯色法測定白及塊莖與非藥用部位中白及多糖含量的比較研究

龍小琴戴應(yīng)和

(1.貴州健康職業(yè)學(xué)院,貴州 銅仁 554300；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 銅仁 554300)

肖培根院士提出藥用植物親緣學(xué),認為中藥存在一定的親緣關(guān)系,在化學(xué)成分、藥理作用等方面有著密切的關(guān)系[1]。在同一種藥用植物不同部位的基礎(chǔ)上開展藥用部位和非藥用部位中化學(xué)成分含量研究,力求尋找新的藥用部位[2,3]。白及為銅仁市重點發(fā)展品牌藥材之一,白及為貴州大宗藥材,藥用價值極高,目前研究發(fā)現(xiàn),白及的主要成分為白及多糖,即白及膠,白及多糖具有活血、止血、消腫、生肌的作用,可以促進局部炎癥物質(zhì)吸收及局部止血,可治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥[4,5]。目前對白及的研究主要集中在白及塊莖的化學(xué)成分和藥理作用的研究,其它非藥部位的研究甚少。臨床上用的是白及干燥塊莖,其它部位去除,并沒有體現(xiàn)其藥用價值,加重了白及的用藥需求,擴大研究白及其它部位中白及膠的含量成為必然趨勢。本課題就銅仁市思南產(chǎn)白及塊莖與白及非藥用部位(葉、莖稈、須根)中白及膠含量進行比較研究,采集銅仁市思南產(chǎn)白及植株,并挑揀白及塊莖和非藥用部位。采用水提醇沉法來提取白及塊莖與非藥用部位中白及多糖,顯色劑用蒽酮-硫酸進行顯色、再用紫外分光光度測白及塊莖與非藥用部位中白及多糖含量。力求尋找新的藥用部位,為緩解臨床用藥需求,為銅仁白及的進一步開發(fā)利用提供參考思路,為白及新的藥用部位資源研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ⅢS,鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；電子天平(BSM-220.4,上海卓精電子科技有限公司)；紅外鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140B,上海副絮實驗室儀器設(shè)備廠)；低速離心機(TDZ5-WSD)；紫外可見分光光度計(TU-1800SPC)。

1.2 試藥

D-無水葡萄糖，中國食品藥品檢定研究院,批號為50-99-7,濃度為100%；蒽酮，分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號為20190305；硫酸，優(yōu)級純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號為20170108；試驗用水為實驗室自制純化水；白及(采于貴州省銅仁市思南縣許家壩鎮(zhèn)中藥材現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū),批號為20201001、20201002、20201003、20201004、20201005、20201006)。以上藥材均經(jīng)銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院梁玉勇教授鑒定為2015版《中華人民共和國藥典》中蘭科植物中的藥用白及[Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.]植株[6]。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 蒽酮-硫酸溶液配制[7]

精密稱取蒽酮0.2011g,置于容器中,用80%的硫酸溶液溶解至100mL,搖勻,配好的0.2%蒽酮-硫酸溶液用棕色瓶保存。

2.1.2 對照品溶液[7]

用電子天平精密稱取D-無水葡萄糖對照品0.0334g,裝到100mL的容量瓶中,用蒸餾水進行溶解,并稀釋至刻度,進行搖勻,即得。以100%計,對照品的濃度為0.334mg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液的制備[8]

取經(jīng)60℃干燥至恒重的白及塊莖和非藥用部位(葉、莖稈、須根),用研缽分別碾碎成粉末狀,分別放入編號的離心管中,再置于干燥器中保存。分別精密稱取樣品粉末1.0g,放入圓底燒瓶中,精密加蒸餾水50.0mL,進行稱重,放入用電套,加熱回流1h(保持微沸),放冷,用蒸餾水補重,搖勻,濾過。用移液管精密量取5.0mL續(xù)濾液,加入30mL無水乙醇,進行搖勻,放置3h,以3500r·min-1離心15min,離心后將上清液倒去,沉淀用適量熱蒸餾水溶解,放冷,置于50mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.1.4 多糖含量測定[8,9]

精密量取1mL供試品溶液,置于10mL試管中,加蒸餾水稀釋到2mL,精密加入0.2%蒽酮-硫酸試液4.5mL顯色；同時取蒸餾水2mL,置于10mL試管中,以加入0.2%蒽酮-硫酸試液4.5mL作為空白,置于紫外-可見分光光度計上在625nm波長處檢測,記錄吸光度。采用標準曲線法計算白及多糖的含量。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液分別為0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,置于10mL刻度試管中,各加蒸餾水至2.0mL,搖勻,另取2.0mL蒸餾水作為空白對照。將刻度試管置于冰水浴中,精密加入顯色劑0.2%蒽酮-硫酸試液4.5mL,混勻,置于沸水浴中3min進行加熱,立即取出置于流水中冷卻10min,以對照品溶液濃度為零的試液為空白。在625nm波長處測定吸光度,以吸光度(y)為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標(x),繪制標準曲線。線性回歸方程y=3.5189x-0.0108,R2=0.999,結(jié)果表明,D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度在5.13～51.38μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗

取1.0mL標準品溶液,加蒸餾水稀釋到2mL,按“2.1.3”中方法連續(xù)測定6次。結(jié)果顯示,所測吸光度的RSD為0.08%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

分別取己配置好樣品溶液、D-無水葡萄糖對照品溶液各1mL,按照“2.1.3”中方法顯色,以相應(yīng)試劑做空白,分別于0～3h內(nèi)每30min測定1次吸光度值,結(jié)果顯示,所測吸光度的RSD分別為0.82%和1.35%,表明樣品和對照品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗

取同一批次的白及樣品6份,按樣品溶液制備項下方法制備樣品溶液,精密量取1mL樣品溶液,按照“2.1.3”中方法進行顯色,測定吸光度值。結(jié)果顯示,多糖含量的RSD為2.48%,說明方法重復(fù)性好。

2.2.5 加樣回收率試驗

取經(jīng)60℃干燥至恒重的白及塊莖和非藥用部位,用研缽分別碾碎成粉末狀,放入離心管中編號保存在干燥器中。精密稱取粉末1.0g,放入圓底燒瓶中,精密加蒸餾水50.0mL,進行稱重,放入用電套,加熱回流1h(保持微沸),放冷,用蒸餾水補重,搖勻,過濾。用移液管精密量取5.0mL過濾液,加入30mL無水乙醇,進行搖勻,放置3h,以3500r·min-1離心15min,離心后將上清液倒去,沉淀在60℃條件下真空干燥,精密稱取樣品0.0501g,沉淀用熱蒸餾水溶解,放冷,置250mL量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,即質(zhì)量濃度均為0.20mg·mL-1,搖勻,備用。精密吸取等量的7份樣品溶液,其中6份加入不等量標準溶液,按照“2.1.3”中方法測定其吸光度值,代入線性回歸方程,確定白及多糖的量,根據(jù)不加標準溶液的樣品溶液的吸光度值,確定樣品中白及多糖的量,結(jié)果見表1。求得平均回收率為98.66%,RSD=1.40%。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3 樣品含量測定

表2含量測定結(jié)果表明,塊莖的白及多糖含量35.12%、須根的白及多糖含量28.82%、莖稈的白及多糖含量20.93%、葉的白及多糖含量16.15%。多糖含量由高到低依次為須根>莖稈>葉。白及塊莖和非藥用部位多糖含量存在一定差異。

表2 多糖含量測定結(jié)果(x±s,n=6)

3 討論

在供試品提取方法的選擇時,采用稀乙醇去除雜質(zhì)后再用水提的方法以及用水提取后再用醇沉淀的方法測定白及多糖含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2種方法測定結(jié)果差異不大,但是稀乙醇去除雜質(zhì)后再用水提的方法過濾時間太長,有部分含量損失,用水提取后再用醇沉淀的方法操作簡便,故選擇水提醇沉法。目前有文獻研究證實苯酚-濃硫酸顯色法存在毒性較大,容易氧化,需純化處理才能進行實驗,操作復(fù)雜,并且在測定樣品測定結(jié)果時重復(fù)性較差；而蒽酮-硫酸顯色法測定結(jié)果時重復(fù)性較好,且操作比較簡便,因此選擇蒽酮-硫酸顯色法進行白及多糖含量測定[10,11]。研究結(jié)果顯示,塊莖的白及多糖含量35.12%、須根的白及多糖含量28.82%、莖稈的白及多糖含量20.93%、葉的白及多糖含量16.15%,多糖含量由高到低依次為須根>莖稈>葉。白及塊莖和非藥用部位(葉、莖稈、須根)多糖含量存在一定差異,可以進一步優(yōu)化白及多糖的純化方法,為有效提高白及非藥用部位的利用,以及白及新的藥用部位資源進一步研究提供參考。