番茄PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白研究進(jìn)展

張琳淳 李越 沈錦純 趙竑博

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

磷(Phosphorus,P)是植物體整個代謝進(jìn)程中的重要化學(xué)物質(zhì)，參與多個植物的生命活動。由于無機(jī)物固定、有機(jī)絡(luò)合物的形成以及營養(yǎng)物質(zhì)在土壤中擴(kuò)散速度緩慢等問題，磷成為世界范圍內(nèi)最難獲得的植物養(yǎng)分之一[1]。植物在發(fā)展變化過程中逐步進(jìn)化出幾種機(jī)制來改善缺磷造成的影響，其中包括植物地下部形態(tài)改變、根周土壤化學(xué)性質(zhì)的改變、AM真菌的定殖以及激活高親和力無機(jī)磷的轉(zhuǎn)運[2]。

植物磷轉(zhuǎn)運蛋白(Phosphate transporter)是控制植物吸收和轉(zhuǎn)運磷酸鹽的重要膜蛋白，存在于植物的線粒體膜、質(zhì)膜和質(zhì)體膜中[3]。植物磷轉(zhuǎn)運蛋白的長度為1500～1800bp，編碼氨基酸個數(shù)為500～600，對磷的吸收和利用起重要作用[3]。當(dāng)植物處于低磷環(huán)境中，植物會通過改變地下部形態(tài)、調(diào)控外源激素、誘導(dǎo)菌根以及誘導(dǎo)高親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白(PTs，Phosphotransferase)等途徑來增強(qiáng)植物對磷的獲取[4]。

在眾多茄科植物中，番茄(Lycopersicon esculentum Mill)在全國乃至全球范圍內(nèi)普遍栽種，是我國重要的蔬菜之一，也是在生物學(xué)和遺傳學(xué)方面用于研究肉質(zhì)漿果發(fā)育的模式植物[5]。缺磷時，番茄植物的生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響，植株矮化以及出現(xiàn)黃化等癥狀，對番茄的產(chǎn)量帶來嚴(yán)重的影響[6,7]。因此，為了提高番茄的產(chǎn)量與質(zhì)量就必須提高番茄植株對磷元素的吸收與轉(zhuǎn)運能力。近幾年，隨著植物高效吸收磷素營養(yǎng)的分子機(jī)制和基因資源的探究逐漸成為熱點，番茄磷轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)研究也逐漸白熱化，這為更好地揭示和應(yīng)用番茄磷轉(zhuǎn)運蛋白家族相關(guān)基因提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。本文綜述了番茄磷轉(zhuǎn)運蛋白PHT1家族基因?qū)Ψ蚜孜蘸娃D(zhuǎn)運的研究進(jìn)展，并對未來番茄PHT1研究的發(fā)展方向提出了展望。

1 磷在番茄生長發(fā)育中的作用

1.1 番茄缺磷癥狀

在番茄植株生長早期，植株處于低磷條件下時，可以觀察到番茄葉背開始出現(xiàn)紫紅色，花青素聚集，而在光合作用下葉片出現(xiàn)了暗綠或灰綠色，葉面積減少，葉片表面無光澤，葉肉組織呈現(xiàn)斑點狀[7-10]。隨著缺磷時間的增長，缺磷癥狀越強(qiáng)烈，威脅番茄植株莖葉的生長發(fā)育，主根生長緩慢，側(cè)根明顯增多，植株莖部積累花青素，葉脈、葉柄及葉簇都呈現(xiàn)紫紅色[11,12]。番茄植株在缺磷時也會影響到氮素的吸收，導(dǎo)致植株葉片卷曲，老葉片逐漸變黃，莖部變得細(xì)小[13]。

1.2 番茄對低磷環(huán)境的適應(yīng)

為了減少低磷造成的傷害，植物在其生長發(fā)育的過程中會形成不同的機(jī)制來進(jìn)行調(diào)控[14]。磷缺乏時，植物通過增加地下部H+和有機(jī)酸含量以及增強(qiáng)高親和性無機(jī)磷轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)等來應(yīng)對磷脅迫，同時，也會造成植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降，細(xì)胞分裂分化減慢，形態(tài)和生理生化變化緩慢，影響植物產(chǎn)量[15,16]。

番茄在低磷脅迫下，植株根長顯著減小，其根的總面積和總體積也呈現(xiàn)出下降趨勢，根毛數(shù)量和密度卻增加，以此來增強(qiáng)植株對磷的吸收[17,18]。有研究表明，磷缺乏會改變番茄地上部與地下部之間的碳水化合物分布，從而促進(jìn)根系的生長和植物對磷酸鹽的吸收[19]。由于低磷環(huán)境會造成植物除根毛以外的根系與土壤中的菌根真菌相互作用形成有益的共生體-菌根(Vesicular-arbuscular mycorrhiza，簡稱VA菌根)[20]。目前在番茄上發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫造成番茄相關(guān)基因受到了菌根系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)[21]。

2 磷轉(zhuǎn)運蛋白

2.1 磷轉(zhuǎn)運蛋白的分類

根據(jù)對磷的親和力大小將磷轉(zhuǎn)運蛋白分為以下2類，高親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白和低親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白[22,23]。再進(jìn)一步細(xì)分為新型的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因PHO1家族(Phosphate1)、高親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因PHT1家族(Phosphate Transporter1)、低親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因PHT2家族(Phosphate Transporter2)和少量PHT3(Phosphate Transporter3)、PHT4(Phosphate Transporter4)、PHO2基因(Phosphate2)的其它基因家族這4大類[24]。

2.2 磷轉(zhuǎn)運蛋白的功能

磷轉(zhuǎn)運蛋白的類型不同，其所處位置和功能也不同，絕大部分的磷轉(zhuǎn)運蛋白在植物的根系中表達(dá)，被認(rèn)為與磷的吸收有關(guān)，小部分在植物的其它部位表達(dá)，被認(rèn)為與磷的轉(zhuǎn)運有關(guān)。PHO1家族主要位于根的維管柱和下胚軸等部位，負(fù)責(zé)木質(zhì)部中磷酸轉(zhuǎn)運體信號調(diào)控[25,26]；PHT1家族主要位于植物根系的細(xì)胞質(zhì)膜上，負(fù)責(zé)植物根系無機(jī)磷的吸收和轉(zhuǎn)運[27]；PHT2家族位于植物質(zhì)體膜上，負(fù)責(zé)無機(jī)磷向載體的轉(zhuǎn)移和代謝[28]；PHO2編碼的蛋白負(fù)責(zé)通過韌皮部將磷從芽向根運輸；PHT3編碼的蛋白位于線粒體膜，負(fù)責(zé)線粒體的無機(jī)磷進(jìn)行交換代謝；PHT4編碼的蛋白位于質(zhì)體和高爾基體中，在光照和晝夜變化條件下，調(diào)控基因影響磷代謝[24,29-32]?？偨Y(jié)上述家族相關(guān)研究參照Ticconi和Abel等，得出磷轉(zhuǎn)運蛋白家族的作用區(qū)域如圖1所示[33]。

圖1 幾種磷轉(zhuǎn)運蛋白家族的作用區(qū)域

2.3 PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)特征

現(xiàn)階段，已檢測到的植物PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白家族成員均為膜蛋白。大多數(shù)具有相似的蛋白序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些膜蛋白的大小均在58KD左右，其中含有的氨基酸殘基個數(shù)約為500[34]。高親和力的磷轉(zhuǎn)運蛋白PHT1家族一般具有12個親脂的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，這12個TM中每個結(jié)構(gòu)域含有20個左右的氨基酸殘基，均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)蛋白的N端和C端，親水性大環(huán)坐落于第6和第7個結(jié)構(gòu)域之間，將12個TM劃分為2組，在二級結(jié)構(gòu)中組成6個結(jié)構(gòu)域-環(huán)-6個結(jié)構(gòu)域“6-環(huán)-6”的結(jié)構(gòu)[35]。第1次被克隆并報道的酵母磷轉(zhuǎn)運體Pho84距今已經(jīng)30a[36]。研究表明，隨著酵母轉(zhuǎn)運體Pho84的同源物和編碼無機(jī)磷活性的蛋白基因在多種植物中逐漸被發(fā)現(xiàn)并鑒定，大多數(shù)植物的PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白是根據(jù)酵母磷轉(zhuǎn)運體Pho84序列進(jìn)行克隆的[37,38]。磷轉(zhuǎn)運體Pho84具有PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白的全部結(jié)構(gòu)特征，可以認(rèn)為是PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白模型。

3 番茄PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白研究進(jìn)展

3.1 番茄PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白在不同組織中的表達(dá)分析

通過對已發(fā)布的番茄基因組序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行廣泛搜索，目前共鑒定出8個PHT1家族基因(LePT1～LePT8)，分布在3條不同的染色體(3、6和9)上[39]。染色體組織和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明如圖2，將8個番茄PHT1家族基因劃分為LePT1/3/7、LePT2/6和LePT4/5/8這3對，其物理距離非常近，是由茄科與其它雙子葉植物科分裂后發(fā)生的串聯(lián)重復(fù)事件產(chǎn)生的[40]。這些PHT1成員的表達(dá)分析表明，除了LePT8在所有組織中都無法檢測到轉(zhuǎn)錄本外，其它7個類似物表現(xiàn)出差異但部分重疊的表達(dá)模式[5]。

圖2 番茄(T)染色體上PHT1基因(LePT1～8)的分布

對番茄植株的表達(dá)模式進(jìn)行分析，分析發(fā)現(xiàn)PHT1家族轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)受外部磷供應(yīng)和葉、根組織類型的影響[41]。LePT1在所有的組織中普遍表達(dá)，如根皮層細(xì)胞、葉片維管束、葉片、莖及花等器官中，當(dāng)?shù)土酌{迫時，其轉(zhuǎn)錄本被大量誘導(dǎo)[23,28,35,42,43]。編碼序列相同的LePT2和LePT6主要在缺磷根中表達(dá)，在磷供給充足的情況下LePT2基因不表達(dá)，在較老的植物根部體內(nèi)的表達(dá)量高于鮮嫩的植物根部[6,45,46]。在低磷脅迫下，叢枝菌根真菌對LePT3～LePT5的活性較強(qiáng)，而高磷脅迫下，叢枝菌根真菌對LePT3～LePT5的活性較弱，均不表達(dá)[47,48]。早期研究表明，大部分PHT1基因都集中在根部表達(dá)，特別是在根表皮和根毛中表達(dá)，表明這些基因在磷缺乏時可能在無機(jī)磷的捕獲和調(diào)控中發(fā)揮作用攝取[23,49]。郭瓏輝利用遺傳轉(zhuǎn)化方法，將番茄的PHT1家族基因LePT1轉(zhuǎn)化進(jìn)擬南芥中，通過高磷、低磷研究證實，PHT1家族基因LePT1啟動子在番茄植株根部活性較強(qiáng)[5]。張傳玲運用VIGS技術(shù)構(gòu)建番茄VIGS載體，對番茄LePT1～LePT8這8個基因的序列及其表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在低磷條件下，LePT1基因表達(dá)量上調(diào)，總根長、總根面積和總根數(shù)等根系結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，植物根與土壤的接觸變得更加緊密，接觸面積增大，有利于土壤對磷的吸收[39]。洪帥利用分子克隆技術(shù)，將番茄PHT1家族基因LePT1和LePT2利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)入水稻中，對LePT1和LePT2進(jìn)行功能探究，結(jié)果表明，當(dāng)植株磷供應(yīng)不足時，水稻根系和水稻葉肉細(xì)胞中的LePT1和LePT2表達(dá)量上調(diào)，增強(qiáng)水稻植株地上部分對磷元素的吸收，株高和生物量呈上升趨勢；然而，當(dāng)磷供應(yīng)過量時，在LePT1和LePT2的過度表達(dá)會抑制水稻植株的發(fā)育，引起植株發(fā)育緩慢，株高降和分蘗數(shù)減少[45]。

3.2 番茄PHT1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白在不同磷濃度下對AMF定殖的響應(yīng)

在整個大自然中，大部分維管植物都與叢枝菌根AM真菌(AMF)共生，通過編碼蛋白質(zhì)對磷運輸進(jìn)行調(diào)控[50]。AM真菌(Glomusintraradices)定殖于植物的根皮質(zhì)細(xì)胞中，AM真菌對磷吸收能力的大小取決于植物與真菌的組合，利用植物的菌絲從根消耗的土壤區(qū)外吸收無機(jī)磷[51,52]。

AM真菌的定殖不僅增加了低磷條件下番茄植株的生物量，還增加了磷濃度；然而在高磷條件下，定殖植株和非定殖植株的生物量和磷濃度卻沒有顯著差異[53,54]。RT-PCR分析表明，只有LePT3、LePT4和LePT5這3個同源基因轉(zhuǎn)錄本可在低磷條件下在接種的根中表達(dá)增強(qiáng)或特異性激活，其中LePT4在AMF定殖的皮層細(xì)胞中表達(dá)；LePT8在任何處理下都不能在2種組織中表達(dá)；其余4個同源基因的表達(dá)均不明顯，在高磷條件下，LePT1、LePT2、LePT6和LePT7的轉(zhuǎn)錄本被顯著抑制[55,56]。在高磷條件下，無論是否有AM定殖，LePT2和LePT7在根和葉組織中的轉(zhuǎn)錄本都急劇減少甚至完全缺失，這種下調(diào)的情況在2個平行基因LePT2和LePT7上更為明顯[50]。在AMF定殖和高磷條件下，LePT1、LePT2、LePT6和LePT7這4個成員的轉(zhuǎn)錄本顯著下調(diào)可能是由于處理后番茄植株中磷濃度的顯著增加引起的[47]。盡管LePT2和LePT6因其編碼序列相同而被認(rèn)為是番茄PHT1家族中最接近的相關(guān)基因，但在低磷條件下，LePT6對AM共生反應(yīng)的下調(diào)幅度遠(yuǎn)小于LePT2[47]。這種表達(dá)水平上的差異強(qiáng)烈表明，在1個相對較新的復(fù)制事件中產(chǎn)生的2個平行序列之后，控制LePT2和LePT6激活或抑制的調(diào)控成分發(fā)生了差異[47]。

研究表明，番茄PHT1基因在AM共生或不同磷濃度下存在特異表現(xiàn)且存在特殊的啟動子元件如MYCS和P1BS，這2個磷調(diào)控元件能激活菌根并誘導(dǎo)PHT1轉(zhuǎn)運蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這2個磷調(diào)控元件中的任何1個元件缺失或突變時，就會導(dǎo)致啟動子活性的降低甚至喪失[57]。2個磷調(diào)節(jié)元件(P1BS和W-box)和1個AM反應(yīng)順勢元件(MYCS)的數(shù)量和定位在這8個PHT1基因的啟動子區(qū)域中差異很大，即使一些同源基因的編碼序列和表達(dá)譜高度保守[58,59]。然而，與其它雙子葉植物中AM誘導(dǎo)的PHT1基因類似，發(fā)現(xiàn)MYCS基序僅存在于3個AM激活的PHT1同源物L(fēng)ePT3、LePT4和LePT5的假定啟動子區(qū)域中，并且與磷調(diào)節(jié)的P1BS元件非常接近[47,60]。

3.3 番茄PHT1家族基因的生物學(xué)功能

3.3.1 參與番茄磷元素的吸收和轉(zhuǎn)運

PHT1家族基因作為功能基因參與番茄對磷的吸收和轉(zhuǎn)運。大多數(shù)的PHT1基因在根部的根毛和根表皮上表達(dá)，參與磷元素的吸收，在植物的其它部位參與磷元素的轉(zhuǎn)運。在運輸過程中，番茄PHT1家族基因體現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)運功能，如磷酸鹽在根冠處的轉(zhuǎn)運、源端到庫端磷酸鹽的轉(zhuǎn)運和從外界環(huán)境攝取磷酸鹽等功能[61,62]。

在自然條件下，植物磷的吸收是通過一個依賴能量的磷酸質(zhì)子共生系統(tǒng)進(jìn)行的。當(dāng)磷缺乏時，植物會通過別的方式來增加磷的吸收。番茄基因表達(dá)的研究結(jié)果表明，LePT1和LePT2的轉(zhuǎn)錄本在磷缺乏的條件下被高度誘導(dǎo)[63]。在番茄缺磷一段時間后，增加的磷吸收被認(rèn)為與根對磷轉(zhuǎn)運的能力更高有關(guān)，也可能是通過形成額外的磷載體[45]。磷轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和定位直接或間接地調(diào)控著磷的獲得，對番茄植株在低磷條件下動態(tài)平衡起著重要作用。Muneer等人對低磷脅迫下番茄葉片中的LePT1和LePT2轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行原位定位，以獲得有關(guān)葉片中磷酸轉(zhuǎn)運蛋白的組織特異性表達(dá)的信息；在表皮和柵欄組織中觀察到LePT1和LePT2轉(zhuǎn)錄物的信號，說明LePT1和LePT2主要存在于葉片的表皮和柵欄組織中；然而，缺磷處理時，番茄葉片表皮的LePT1和LePT2比柵欄組織的表達(dá)量高，說明LePT1和LePT2參與了磷的吸收和轉(zhuǎn)運[5,63]。

3.3.2 對番茄抗性的影響

在番茄抗性方面，張殊慧運用基因槍法將番茄中線粒體磷轉(zhuǎn)運蛋白LePT3基因克隆進(jìn)冬小麥中，將冬小麥分別處于不同的磷處理條件下。通過觀察分析可知，在番茄磷轉(zhuǎn)運蛋白LePT3基因的調(diào)控下，冬小麥缺磷時，小麥根系結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，根系活性、酸性磷酸酶活性和小麥光合能力均發(fā)生改變，呈現(xiàn)上升趨勢；番茄線粒體磷轉(zhuǎn)運蛋白LePT3基因在磷轉(zhuǎn)運調(diào)控中起重要作用。當(dāng)磷充足時，轉(zhuǎn)基因小麥的根系結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化。在番茄磷轉(zhuǎn)運蛋白LePT3基因的調(diào)控下，將促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小麥養(yǎng)分的運輸[64]。郭瓏輝等人將番茄高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白LePT1基因進(jìn)行克隆，在擬南芥突變體中進(jìn)行互補(bǔ)表達(dá)研究其功能特性，發(fā)現(xiàn)缺磷培養(yǎng)和正常培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株比擬南芥突變體的根部有效濃度略高[5]。

3.3.3 影響植物生長發(fā)育

由于無機(jī)磷的毒性，磷轉(zhuǎn)運蛋白在提高植物生長和產(chǎn)量方面會呈現(xiàn)出消極作用[65]。番茄PHT1家族基因的表達(dá)對植物生物生長發(fā)育的影響可能通過以下2條途徑，影響磷元素的攝取和影響植物所需的其它營養(yǎng)元素合成。如，miR399在擬南芥和番茄中的過度表達(dá)導(dǎo)致了磷毒性和生長遲緩[66,67]。張傳玲借助VIGS技術(shù)沉默番茄LePT1基因發(fā)現(xiàn)在正常磷處理中，LePT1、WT、TRV植株在根、莖、葉中全磷含量以及在其它表觀性狀上均無顯著差異，但是LePT1基因沉默植株的總根面積與對照植株相比明顯偏小。在低磷脅迫環(huán)境中，LePT1基因沉默植株生物量、全磷含量、總根長、總根面積都顯著低于對照植株，說明LePT1基因的沉默限制了番茄植株的生長發(fā)育[39]。

4 總結(jié)和展望

我國番茄的種植面積高居世界各國種植面積前列，具有良好的發(fā)展前景。栽培生產(chǎn)中，番茄難以吸收利用土壤中有效磷元素以及缺磷脅迫嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量與品質(zhì)[11]。在分子信息的時代背景下，利用基因工程等現(xiàn)代分子育種技術(shù)對作物進(jìn)行改良或選育，培育出能高效吸收和利用磷元素的作物彌補(bǔ)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷元素缺乏限制的重要手段。

目前，盡管對番茄PHT1家族基因有了一定的研究，然而，在番茄中發(fā)現(xiàn)的8個PHT1家族基因，多集中在LePT1和LePT2基因的研究上，對LePT3～LePT8基因的研究較少，需補(bǔ)充更多的研究。關(guān)于組織表達(dá)模式的分析也集中于LePT1和LePT2基因的研究上，對LePT3～LePT8基因的表達(dá)研究不夠深入，特別是LePT8基因，其在所有植物組織中還沒有找到轉(zhuǎn)錄本。在與AM真菌的協(xié)作中，LePT8基因依舊在組織中檢測不到，由于AM真菌的定殖，番茄植株的生物量在低磷條件下呈增長趨勢，對土壤中的磷濃度也有所提升；在高磷條件下，部分基因成員轉(zhuǎn)錄本呈直線下降趨勢。說明AM真菌的定殖對低磷條件下番茄植株的生長起到了積極調(diào)控作用，但是AM真菌的具體調(diào)控機(jī)制尚未明晰，還有待研究。

雖然番茄PHT1家族基因具有各自的生物學(xué)功能，并且對其功能也有所了解，如番茄PHT1家族基因可調(diào)控磷元素的吸收和轉(zhuǎn)運、影響植物抗性和對植物生長發(fā)育產(chǎn)生影響等，但是基因與基因之間的交互作用還不清楚；還有大部分PHT1家族基因成員的磷轉(zhuǎn)運機(jī)制需要闡明；磷的動態(tài)平衡與再分配也需要進(jìn)行深層次的研究發(fā)掘其本質(zhì)。這些對磷吸收和轉(zhuǎn)運效率的提高有著重要的意義，對未來解決缺磷脅迫下如何提高番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量這一問題指明了方向。