鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重組蛋白的表達(dá)及其體外抑菌活性特征

唐 佳，倪興振，邢皓程，王佑笑，楊倩曦，閆智聰，周 智，趙建民

（1. 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海口 570228; 4. 海南華僑中學(xué)，?？?570226）

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是重要的海洋生態(tài)系統(tǒng)之一，棲息著全球多達(dá)四分之一的海洋生物，被譽(yù)為“海洋中的熱帶雨林”，為人類提供了食物、生態(tài)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)文化等服務(wù)[1-2]。造礁石珊瑚是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的支柱生物，其通過(guò)與蟲黃藻和細(xì)菌等微生物共生來(lái)適應(yīng)強(qiáng)光照寡營(yíng)養(yǎng)的礁區(qū)環(huán)境，因此維持健康的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)造礁石珊瑚的健康尤為重要。當(dāng)前全球氣候變暖導(dǎo)致的海水升溫迫使造礁石珊瑚外排共生蟲黃藻，珊瑚因營(yíng)養(yǎng)短缺而免疫力下降，機(jī)會(huì)致病菌[例如：溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）]的致病力相對(duì)顯著提升，造成了某些珊瑚疾病的爆發(fā)率顯著升高[3]。因此，亟需開展造礁石珊瑚免疫防御機(jī)制的相關(guān)研究，尤其是高溫對(duì)珊瑚免疫的影響。造礁石珊瑚與其他無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，依靠固有免疫應(yīng)答來(lái)識(shí)別和清除入侵的病原菌等微生物[4]。此外，珊瑚還能通過(guò)固有免疫應(yīng)答控制共附生菌群中病原菌的數(shù)量和比例，進(jìn)而降低病原菌的潛在威脅[5]。珊瑚的凋亡、自噬、抗菌肽、氧化還原系統(tǒng)、酚氧化酶系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)等均參與了致病微生物的控制和清除[6-7]。抗菌肽是生物中普遍存在的一類陽(yáng)離子活性多肽，是機(jī)體非特異性免疫的關(guān)鍵因子之一，目前已從多種無(wú)脊椎動(dòng)物中分離出具有活性的抗菌肽[8]。近年來(lái)，分子生 物學(xué)和基因組學(xué)的迅猛發(fā)展促進(jìn)了免疫相關(guān)基因的挖掘，更好地推動(dòng)珊瑚固有免疫應(yīng)答和共附生菌群調(diào)控的深入研究。溶菌酶屬于抗菌肽家族，是生物體內(nèi)一種具有殺菌作用的重要抗菌蛋白，其通過(guò)催化水解細(xì)胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間形成的β-1，4糖苷鍵而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁[9-12]。目前，已有許多研究聚焦于無(wú)脊椎動(dòng)物的溶菌酶，但對(duì)造礁石珊瑚，甚至刺胞動(dòng)物中溶菌酶的了解還不清楚，僅有類溶菌酶活性的相關(guān)報(bào)道，且缺乏確切的分子證據(jù)[13-14]。例如，有研究表明受黃帶病影響的珊瑚（Orbicella faveolata）中具有較高的類溶菌酶活性[15]；海扇可能通過(guò)增加類溶菌酶和殼多糖酶活性抵抗微生物入侵[16]；華麗黃?？ˋnthopleura elegantissima）和等指?？ˋctinia equina）的粘液均具有類溶菌酶活性[17-18]。鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damicornis）隸屬動(dòng)物界（Animalia）、刺胞動(dòng)物門（Cnidaria）、珊瑚綱（Anthozoa）、石珊瑚目（Scleractinia）、杯形珊瑚科（Pocilloporidae）、杯形珊瑚屬（Pocillopora），廣泛分布于太平洋和印度洋的熱帶和亞熱帶淺海海域。鹿角杯形珊瑚已作為模式生物用于探究造礁石珊瑚對(duì)病原菌，以及病原菌和高溫交互作用的響應(yīng)研究中。例如，BEN-HAIM等[19]分離出一種溫度依賴型的溶珊瑚弧菌，該病原菌在水溫超過(guò)26 ℃時(shí)，可在2周內(nèi)迅速破壞鹿角杯形珊瑚的組織[19]。筆者克隆了鹿角杯形珊瑚的溶菌酶基因PdLYZ，隨后體外誘導(dǎo)表達(dá)并純化PdLYZ重組蛋白，同時(shí)測(cè)定PdLYZ重組蛋白對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli），變異鏈球菌（Streptococcus mutans）和溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus）的抑菌活性，還探究了PdLYZ重組蛋白在高溫條件下對(duì)病原菌溶珊瑚弧菌抑制活力的變化，從而揭示溶菌酶在珊瑚免疫應(yīng)答中扮演的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)生物鹿角杯形珊瑚采自文昌市銅鼓嶺岸礁，采后置于盛有500 L天然海水的玻璃缸中暫養(yǎng)1個(gè)月。暫養(yǎng)條件：溫度26 ℃，鹽度35，光照∶黑暗時(shí)間為12 h∶12 h。受試菌株：大腸桿菌（E. coli，A TCC 25922）、變異鏈球菌（S. mutans，ATCC 700610）和溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus，SCSIO 43001）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase Kit購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；PCR試劑、PCR克隆試劑盒（PMD19-T Vector Cloning Kit和MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、Trans BL21（DE3）pLysS化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和連接轉(zhuǎn)化試劑盒（pEASY-E1 Expression Kit）購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；鎳瓊脂糖凝膠FF購(gòu)自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；其他試劑購(gòu)自生工生物工 程（上海）股份有限公司或北京索萊寶科技有限公司。

1.3 鹿角杯形珊瑚總RNA提取和cDNA合成將珊瑚小枝置于液氮中充分研磨后加入1 mL Trizol，收集研磨液，將研磨液在5 000 g 4 ℃下離心5 min后去除珊瑚的碳酸鈣骨骼，然后參考STEFANIK等[20]報(bào)道的方法提取鹿角杯形珊瑚的總RNA。利用M-MLV Reverse Transcriptase Kit將RNA反轉(zhuǎn)獲得cDNA第 一鏈，將獲得的cDNA稀釋100倍后用于PdLYZ基因的克隆。

1.4 PdLYZ基因的克隆和序列分析基于本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)序和組裝的鹿角杯形珊瑚轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，采用局部序列排比檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索到1條與其他已鑒定的溶菌酶基因同源的轉(zhuǎn)錄本，且該轉(zhuǎn)錄本的序列含有1個(gè)完整的開放閱讀框。為了擴(kuò)增PdLYZ基因開放閱讀框的序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer premier 5.0）設(shè)計(jì)2條特異性引物PdLYZ_F（5′-AAATGTGACCCAAAACC ATCGA -3′）和PdLYZ_R（5′-AATCAGCATCCAGCTTTAATGATT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min），72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit進(jìn)行純化，然后將該片段連接到PMD19-T載體中并轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選PCR鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證序列。

使用BLAST工具在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.gov/blast）中檢索PdLYZ的同源基因和蛋白。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)（https://web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算PdLYZ蛋白的理論等電點(diǎn)和相對(duì)分子量，采用SignalP 4.1數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）分別預(yù)測(cè)PdLYZ蛋白的信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域。PdLYZ蛋白和其他生物溶菌酶的多序列比對(duì)通過(guò)ClustalX軟件完成，然后通過(guò)多序列對(duì)比顯示工具（http://www.bio-soft.net/sms/index.html）進(jìn)行可視化展示。PdLYZ蛋白和其他溶菌酶的進(jìn)化分析利用MEGA-X軟件中的鄰接法（ neighbor-joining，NJ）完成，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示1 000次復(fù)制的自展值，用于檢驗(yàn)進(jìn)化樹分支的可信度。

1.5 PdLYZ重組蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性以pMD19-T-PdLYZ質(zhì)粒作為模板，并使用特異性引物PdLYZ_F和PdLYZ_R擴(kuò)增編碼PdLYZ成熟肽的序列，將擴(kuò)增的PdLYZ成熟肽插入pEASY-E1表達(dá)載體中，然后將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEASY-E1-PdLYZ轉(zhuǎn)化至Trans BL21（DE3）pLysS化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽(yáng)性單克隆菌落接種到200 mL含氨芐青霉素（100 g·L-1）的盧里亞-貝爾塔尼培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）培養(yǎng)至OD600約0.6，并添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）（終濃度1 mmol L-1）誘導(dǎo)PdLYZ重組蛋白表達(dá)。離心、收集菌細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎（工作5 s，間隙20 s，功率200 W），破碎至菌液澄清后，12 000 r·min-14 ℃下離心30 min，收集上清液用于蛋白純化。

采用鎳瓊脂糖凝膠FF對(duì)帶有His標(biāo)簽的PdLYZ重組蛋白進(jìn)行純化，將純化后的PdLYZ蛋白裝入透析袋中，在4 ℃條件下依次用含有8、6、4、2、1、0 mol· L-1的尿素透析液（50 mmol· L-1Tris，50 mmol· L-1NaCl，1 mmol· L-1EDTA-2Na，1 mmol ·L-1還原型谷胱甘肽，2 mmol· L-1氧化型谷胱甘肽，133 mmol· L-1甘氨酸）中進(jìn)行復(fù)性。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢驗(yàn)PdLYZ重組蛋白的表達(dá)，純化和復(fù)性結(jié)果。最后，參考BCA快速蛋白定量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定 PdLYZ重組蛋白的濃度。

1.6 PdLYZ重組蛋白對(duì)大腸桿菌和變異鏈球菌抑菌活性的測(cè)定PdLYZ重組蛋白對(duì)大腸桿菌和變異鏈球菌抑菌活性的測(cè)定參考ZHOU Z等[21]的方法并稍有修改。將供試菌（大腸桿菌和變異鏈球菌）在37 ℃200 r·min-1下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供試菌菌液在10 000 g 4 ℃下離心15 min收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用PBS緩沖液洗2次后重懸至菌濃度為104cfu ·mL-1，取50 μL菌液，加入250 μL PdLYZ重組蛋白，混勻后37 ℃孵育0.5 h，采用等濃度的牛血清蛋白（BSA蛋白）作為對(duì)照。然后取20 μL混合液加入200 μL培養(yǎng)基（大腸桿菌：LB培養(yǎng)基；變異鏈球菌：腦心浸出液肉湯（BHI）培養(yǎng)基），37 ℃ 200 r·min-1培 養(yǎng)，每隔1 h在600 nm處測(cè)定吸光度的變化。

1.7 PdLYZ重組蛋白在不同溫度下對(duì)溶珊瑚弧菌抑制活性的測(cè)定溶珊瑚弧菌26 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照1.6部分的方法獲取PdLYZ重組蛋白和溶珊瑚弧菌共孵育的菌液，然后取20 μL混合液加入200 μL 2216E液體培養(yǎng)基，分別于26 ℃和37 ℃下200 r·min-1培養(yǎng)，每隔1 h在600 nm處測(cè) 定吸光度的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdLYZ基因的分子特征PdLYZ的開放閱讀框長(zhǎng)648 bp，編碼215個(gè)氨基酸。利用SignalP 4.1數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PdLYZ推導(dǎo)蛋白的N末端有23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。NCBI-CDD保守結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，PdLYZ蛋白含有1個(gè)類溶菌酶超家族結(jié)構(gòu)域（Ile31-Gly214）。ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果揭示PdLYZ成熟肽的分子量標(biāo)準(zhǔn)和理論等電點(diǎn)分別為22.05 kDa和8.84。

多序列比對(duì)的結(jié)果顯示，PdLYZ與萼柱珊瑚（Stylophora pistillata）中的溶菌酶（XP_022779194.1）有41.47%的相似性；與指狀鹿角珊瑚（Acropora digitifera）中的溶菌酶（XP_015770608.1）有43.33%的相似性；與海綿Amphimedon queenslandica的溶菌酶（XP_011407575.1）具有30.65%相似性。上述4種生物溶 菌酶序列的多重比較共揭示5個(gè)保守的半胱氨酸（Cys26，Cys41，Cys116，Cys197，Cys204）（圖1）。

圖1 PdLYZ序列與其他生物溶菌酶序列比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Multiple alignment of PdLYZ amino acid sequence with that of other animals in GenBank.Sp：柱狀珊瑚Stylophora pistillata ; Ad：鹿角珊瑚Acropora digitifera; Pd：杯形珊瑚Pocillopora damicornis; Aq：海綿Amphimedon queenslandica。*代表保守的半胱氨酸。The asterisk below indicates conserved cysteine residues.

2.2 PdLYZ蛋白的進(jìn)化分析基于PdLYZ蛋白的氨基酸序列采用Blastp檢索NCBI中的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源蛋白，發(fā)現(xiàn)PdLYZ蛋白與其他無(wú)脊椎動(dòng)物的溶菌酶相似性為30.65%～44.78%；與細(xì)菌和藻類的溶菌酶相似性為25.54%～49.15%。其中與細(xì)菌Gammaproteobacteria bacterium（RKZ98632.1）的溶

菌酶相似性最高，達(dá)49.15%。利用MEGA-X軟件的NJ方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。在進(jìn)化樹中，PdLYZ首先和珊瑚、海綿的溶菌酶聚成一支，而細(xì)菌、藻和貝類的溶菌酶則聚成另一個(gè)獨(dú)立的分 支。

圖2 不同生物溶菌酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of lysozymes from different organismsSp：柱狀珊瑚Stylophora pistillata; Of：星珊瑚Orbicella faveolate; Am：鹿 角 珊 瑚Acropora millepora; Nv：?？鸑ematostella vectensis; Ed：?？鸈xaiptasia diaphana; At：?？鸄ctinia tenebrosa; Dg：軟珊瑚 Dendronephthya gigantea;Ta：錦蟾Thalassophryne amazonica; Sf：硬骨舌魚Scler opages formosus; Gm：鱈魚Gadus morhua.

2.3 PdLYZ重組蛋白的表達(dá)與純化為了進(jìn)一步揭示PdLYZ在鹿角杯形珊瑚中的生物學(xué)功能，利用IPTG誘導(dǎo)已轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pEASY-E1-PdLYZ的E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)PdLYZ重組蛋白。采用鎳柱純化體外表達(dá)的PdLYZ重組蛋白，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，PdLYZ分子量為22.05 kDa（圖3），與ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的蛋白相對(duì)分子量一致。測(cè)定純化透析后的PdLYZ重組蛋白 濃度為0.1 g·L-1。

圖3 PdLYZ重組蛋白的表達(dá)與純化M：蛋白marker；1：未誘導(dǎo)組蛋白的表達(dá)；2：誘導(dǎo)組蛋白的表達(dá)；3：鎳柱純化后的PdLYZ蛋白。Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant PdLYZ protein.Lane M: protein molecular weight marker. Lane 1: protein expression of control group, not induced; Lane 2: protein expression of induced group; Lane 3: PdLYZ protein purified by Ni2+ chelating Sepharose colum.

2.4 PdLYZ重組蛋白對(duì)大腸桿菌和變異鏈球菌的抑制活性 在37 ℃下，PdLYZ重組蛋白能抑制大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和變異鏈球菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）的生長(zhǎng)。PdLYZ重組蛋白在3、4 h能顯著抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，抑制率分別為49.48%和22.46%（圖4）。PdLYZ重組蛋白在3、4 h能顯著抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)，抑制率分別為53.64%和26.45%（圖5）。

圖4 PdLYZ重組蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，rLYZ：PdLYZ重組蛋白；BSA：牛血清蛋白（CK）。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），*代表顯著性差異（P＜0.05）。Fig. 4 Inhibitory activity of recombinant PdLYZ protein against Escherichia coli.rLYZ: recombinant PdLYZ protein; BSA：bovine serum albumin (CK). Values are presented as the mean ± SD (n=3), and* represents significant difference (P ＜ 0.05).

圖5 PdLYZ重組蛋白對(duì)變異鏈球菌的抑菌活性，rLYZ：PdLYZ重組蛋白；BSA：牛血清蛋白（CK）。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），*代表顯著性差異（P＜0.05）。Fig. 5 Inhibitory activity of recombinant PdLYZ protein against Streptococcus mutansi.rLYZ: recombinant PdLYZ protein; BSA: bovine serum albumin (CK). Values are presented as the mean ± SD (n=3), and* represents significant difference (P＜0.05).

2.5 不同溫度下PdLYZ重組蛋白對(duì)溶珊瑚弧菌的抑制活性在26 ℃和32 ℃下測(cè)定了PdLYZ重組蛋白對(duì)溶珊瑚弧菌生長(zhǎng)的抑制活性。PdLYZ重組蛋白在2種溫度下均能顯著抑制溶珊瑚弧菌生長(zhǎng)。26 ℃時(shí)PdLYZ重組蛋白在7 h對(duì)溶珊瑚弧菌生長(zhǎng)的抑制率高達(dá)70.50%（P＜0.05），32 ℃時(shí)PdLYZ重組蛋白在 6 h對(duì)溶珊瑚弧菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)47.93%（圖6）。

圖6 在26 ℃和32 ℃下，PdLYZ重組蛋白對(duì)溶珊瑚弧菌的抑菌活性rLYZ：PdLYZ重組蛋白；BSA：牛血清蛋白（CK）。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），*代表顯著性差異（P＜0.05）。Fig. 6 Inhibitory activity of recombinant PdLYZ protein against Vibrio coralliilyticus at 26 ℃ and 32 ℃.rLYZ: recombinant PdLYZ protein; BSA：bovine serum albumin (CK). Values are presented as the mean ± SD (n=3),and * represents significant difference (P＜0.05).

3 討 論

病原菌導(dǎo)致的珊瑚疾病對(duì)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)造成的影響不容小覷，尤其是在全球氣候不斷變暖的背景下。溶菌酶是廣泛存在于各種生物的一類抗菌分子，在無(wú)脊椎動(dòng)物固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)探究了鹿角杯形珊瑚溶菌酶的分子特征及其生物學(xué)功能，揭示了溶菌酶可能參與珊瑚免疫應(yīng)答。鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ基因的cDNA開放閱讀框長(zhǎng)648 bp，編碼215個(gè)氨基酸，其序列與其他生物的溶菌酶相似性為25.54%～49.15%。鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ推導(dǎo)蛋白的N末端有1條由23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，表明PdLYZ蛋白分泌到細(xì)胞外行使功能。此外，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ含有1個(gè)類溶菌酶超家族的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ谌芫傅囊志δ芸赡苤陵P(guān)重要。MEGA軟件構(gòu)建鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ和其他生物溶菌酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果表明，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ和珊瑚、海綿的溶菌酶聚成1支，而細(xì)菌、藻和貝類的溶菌酶則聚成另外1個(gè)獨(dú)立的分支；系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果表明，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ是溶菌酶在鹿角杯形珊瑚中的同源酶，而且它可能擁有與其他動(dòng)物中的同源酶相似的生物學(xué)活性。

造礁石珊瑚健康菌群的維持與珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的健康密切相關(guān)。為探究溶菌酶在珊瑚免疫應(yīng)答中的可能作用，本研究測(cè)定了鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重組蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌變異鏈球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌和病原菌溶珊瑚弧菌的抑制活性。結(jié)果表明，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重組蛋白對(duì)變異鏈球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用。PdLYZ重組蛋白可能通過(guò)破壞變異鏈球菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，即催化水解細(xì)胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間形成的β-1，4糖苷鍵[22]，來(lái)抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)。對(duì)于大腸桿菌和溶珊瑚弧菌而言，PdLYZ重組蛋白可能通過(guò)與脂多糖（LPS）的結(jié)合活性發(fā)揮抑菌作用[23]。相似的報(bào)道已證明海參、蟹、蝦和貝等無(wú)脊椎動(dòng)物中的溶菌酶也對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均具有抑制作用[9,24-26]。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的溶菌酶可能比陸地?zé)o脊椎動(dòng)物的活性范圍更廣，便于應(yīng)對(duì)復(fù)雜海洋環(huán)境中多樣性更高的病原菌[27]。PdLYZ重組蛋白廣泛的抑菌活性表明溶菌酶可能參與珊瑚機(jī)體的防御免疫。

溶珊瑚弧菌是一種廣為報(bào)道的珊瑚病原菌，海水升溫會(huì)加劇溶珊瑚弧菌對(duì)珊瑚的致病力[28]。為探究溶菌酶在珊瑚應(yīng)對(duì)未來(lái)全球氣候變暖中的可能作用，本研究測(cè)定了與PdLYZ重組蛋白（實(shí)驗(yàn)組）或BSA蛋白（對(duì)照組）共孵育后，溶珊瑚弧菌在26 ℃和32 ℃下的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，高溫會(huì)加速溶珊瑚弧菌的生長(zhǎng)，病原菌的快速生長(zhǎng)可能觸發(fā)珊瑚固有免疫應(yīng)答，溶菌酶作為固有免疫的關(guān)鍵組成部分，通常被認(rèn)為是抵抗病原菌感染的第一道防線。本研究結(jié)果表明，PdLYZ重組蛋白在常溫及高溫條件下能顯著抑制溶珊瑚弧菌的生長(zhǎng)，且其抑菌能力在高溫條件下更強(qiáng)。這與在其他生物中的研究一致，STABILI[17]研究結(jié)果表明，海葵A. equina粘液中類溶菌酶的抑菌活性在高溫條件下較強(qiáng)，黃金鳳等[29]研究結(jié)果表明，松浦鏡鯉幼魚溶菌酶活性隨溫度升高而顯著增加。此外，PdLYZ重組蛋白在高溫條件下會(huì)在前期顯著抑制病原菌生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，PdLYZ蛋白對(duì)于鹿角杯形珊瑚在未來(lái)氣候變暖中可能會(huì)降低病原菌的數(shù)量和比例，對(duì)抑制珊瑚疾病的爆發(fā)具有重要意義。綜上所述，本研究克隆得到一個(gè)鹿角杯形珊瑚的溶菌酶基因，其蛋白含有類溶菌酶超家族結(jié)構(gòu)域，其重組蛋白對(duì)于大腸桿菌、變異鏈球菌和溶珊瑚弧菌均具有抑制作用，且在高溫條件下會(huì)在前期顯著抑制溶珊瑚弧菌的生長(zhǎng)。由此筆者推測(cè)溶菌酶在珊瑚免疫應(yīng)答中可能扮演著重要作用。