套作白三葉草對(duì)香蕉枯萎病發(fā)病率及土壤微生物群落的影響

劉滿意，王禹童，孫銘澤，李 榮，王蓓蓓

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？?570228; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

香蕉枯萎病又稱(chēng)巴拿馬病、黃葉病，是一種典型的導(dǎo)致維管束系統(tǒng)毀滅的土壤真菌病害，首次于1904年在美國(guó)夏威夷被發(fā)現(xiàn)[1-2]，是由古巴專(zhuān)化型的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysopoyumf. sp.Cubence)引起[3]，在香蕉的整個(gè)生育期內(nèi)都會(huì)出現(xiàn)。尖孢鐮刀菌會(huì)破壞維管束結(jié)構(gòu)、堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管，從而引起假莖開(kāi)裂、葉片發(fā)黃等癥狀，最終植株枯萎死亡。一百多年來(lái)，香蕉土傳枯萎病一直是全球香蕉產(chǎn)業(yè)最大的障礙，在許多國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道，并造成嚴(yán)重的危害[4]。研究表明，長(zhǎng)期的香蕉連作使土壤酸度增加，病原菌積累，土壤微生物群落失衡[5-7]。目前，對(duì)香蕉連作障礙采用的措施主要有：選育抗病品種、化學(xué)藥劑、施用生物有機(jī)肥和輪作[8-11]。但是，香蕉是無(wú)性繁殖，選育抗病品種非常困難；化學(xué)藥劑對(duì)土壤和農(nóng)作物污染嚴(yán)重；生物肥料的防治效果還有待提升；輪作不利于保持香蕉的經(jīng)濟(jì)效益[12]。因此，現(xiàn)在急需一種有效的防治香蕉枯萎病的方法[13]。近年來(lái)，利用套作來(lái)調(diào)控土壤微生物群落的報(bào)道逐漸增多。研究表明，玉米與花生套作能有效地改變土壤微生物的群落組成和優(yōu)勢(shì)物種的種類(lèi)[14]。張蒙蒙等[15]的研究結(jié)果表明，桑樹(shù)與紫花苜宿套作能改善土壤真菌的多樣性，增加真菌的豐富度。香蕉與韭蔥套作能有效地減少土壤中總鐮刀菌的數(shù)量[16]，套作豆類(lèi)和谷類(lèi)作物可以提高豆科固氮能力[17]，芥菜套作豆科作物增加了產(chǎn)量穩(wěn)定性、養(yǎng)分有效性和水分利用效率[18]。目前，關(guān)于香蕉行間套作的研究不多，尤其是套作豆科綠肥的研究較少。在黃瓜園中套作白三葉草(Trifolium repensL)，可顯著降低黃瓜枯萎病發(fā)病率[19]。因此，筆者以白三葉草為套作作物，以不套種為對(duì)照，研究套作白三葉草對(duì)連作蕉園香蕉枯萎病的發(fā)病率以及土壤微生物的多樣性、結(jié)構(gòu)和組成的影響，旨在為套作防控香蕉枯萎病和改善蕉園土壤微生物生境提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況本試驗(yàn)于2018年9月至2019年6月在海南省澄邁縣香蕉基地（19°N，109°E）進(jìn)行。該地區(qū)屬熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫23.8 ℃，降水量1 786.1 mm，且熱雨同季，臺(tái)風(fēng)影響較弱；試驗(yàn)田土壤為磚紅壤（連續(xù)單作香蕉8年）。土壤基本化學(xué)性質(zhì)：pH 5.53，堿解氮93.47 mg·kg-1，銨態(tài)氮14.19 mg·kg-1，硝態(tài)氮10.81 mg·kg-1，速效磷96.57 mg·kg-1，速效鉀672 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)3.64 g·kg-1。試驗(yàn)田所種香蕉品種 為巴西蕉（Mimosa nanaLour.），1株留1個(gè)吸芽。供試綠肥為白三葉草(Trifolium repensL)。

1.2 試驗(yàn)方案2018年9月將白三葉草進(jìn)行地面撒播。設(shè)置處理如下：?jiǎn)巫飨憬?MB)、香蕉套作白三葉草（IB）。每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)分布，并設(shè)置保護(hù)行。每個(gè)重復(fù)小區(qū)種植60棵香蕉，寬窄行種植，寬行行距3 m，窄行行距2 m，香蕉株距2 m。綠肥在香蕉寬行間撒播，白三葉草行距30 cm，播種量為6 kg·hm-2，為常規(guī)播種量。水分管理：苗期和果實(shí)成熟期使田間持水量保持在75%左右，快速生長(zhǎng)期、抽蕾期和果實(shí)生長(zhǎng)期使田間持水量保持在85%左右。施肥管理：底肥，每株施腐熟的羊糞有機(jī)肥5 kg，同時(shí)添加磷肥0.2 kg，均勻拌入施肥穴；前期追肥（前3個(gè)月），每15～20 d追施1次肥，每株每次淋施15 g尿素和15 g硫酸鉀復(fù)合肥(15-15-15)；中期追肥（快速生長(zhǎng)期至抽蕾前），每15～20 d追施1次肥，每株每次淋施15 g尿素、60 g硫酸鉀復(fù)合肥和160 g硫酸鉀；后期追肥（抽蕾期至采收期），每25～30 d追施1次肥，每株每次淋施50 g尿素、80 g硫酸鉀復(fù)合肥和110 g硫酸鉀。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定方法在田間試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集土壤樣品，各重復(fù)小區(qū)選取5株健康香蕉，在香蕉滴水線以?xún)?nèi)用土鉆隨機(jī)取4個(gè)土樣，收集5～20 cm的表層土壤，然后將這5株香蕉的土樣混合為1個(gè)土壤樣品。每個(gè)處理采集3個(gè)重復(fù)，共15株香蕉。取土后過(guò)2 mm篩，用四分法取約100 g放入超低溫冰箱，用來(lái)提取DNA，用于高通量測(cè)序；取約300 g土風(fēng)干后測(cè)定化學(xué)性質(zhì)。

在種植中，自出現(xiàn)典型香蕉枯萎病癥狀時(shí)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。當(dāng)香蕉植株出現(xiàn)黃葉、假莖開(kāi)裂并呈褐色、新葉較小等典型的癥狀，即統(tǒng)計(jì)為發(fā)病植株，每7 d調(diào)查1次，直至試驗(yàn)結(jié)束。香蕉枯萎病的發(fā)病率按下式計(jì)算：

用pH計(jì)法測(cè)定土壤pH值（m水∶V土=1∶2.5），油浴法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)，擴(kuò)散堿解法測(cè)定土壤堿解氮，0.03 mol·L-1氟化銨-鹽酸(0.025 mol·L-1)浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤速效磷，1 mol·L-1中性乙酸銨溶液浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定土壤速效鉀。2 mol·L-1氯化鉀溶液浸提-紫外分光光度計(jì)法測(cè)硝態(tài)氮，2 mol·L-1氯化鉀溶液浸提-靛酚藍(lán)比色法測(cè)銨態(tài)氮。具體方法詳見(jiàn)《土壤農(nóng)化分析》[20]。

將每個(gè)重復(fù)的土壤樣品提取2次DNA，取約0.8 g混合土壤樣品，用MOBIO的土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）提取土壤DNA。每個(gè)處理共提取6次DNA。提取好的DNA用核酸定量?jī)x（NanoDrop 2000，Thermo Scientific，USA）測(cè)定其核酸濃度后于-20 ℃冰箱保存。每個(gè)重復(fù)分別吸取20 μL樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。細(xì)菌16S rRNA (V3+V4)區(qū)域采用引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，真菌ITS1區(qū)域采用引物：5′-C TTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.4 數(shù)據(jù)處理測(cè)序返回的原始序列用USEARCH 11按標(biāo)準(zhǔn)流程分析。用97%相似性的稀疏曲線來(lái)判斷測(cè)序深度的合理性。Mothur軟件用于Alpha及Beta多樣性分析?；谪惾~斯距離（Bray-distance）進(jìn)行各處理間的主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis），用于比較各處理土壤中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)差異。

采用Microsoft Excel 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖，采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)分析軟件，通過(guò) 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，檢驗(yàn)處理間的差異顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 套作白三葉草對(duì)香蕉枯萎病發(fā)病率的影響與單作香蕉處理相比，套作白三葉草處理顯著降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率（圖1-a）和尖孢鐮刀菌的相對(duì)豐度（圖1-b）。單作香蕉處理和套作白三葉草處理的香蕉枯萎病發(fā)病率分別為41.67%和28.33%，尖孢鐮刀菌相對(duì)豐度分別為13.10%和7.04%。相比于單作香蕉處理，香蕉套作白三葉草處理枯萎病發(fā)病率降低了13.34%，尖孢鐮刀菌相對(duì)豐度減少了6.06%。

圖1 不同處理的香蕉枯萎病發(fā)病率和尖孢鐮刀菌相對(duì)豐度注：MB：?jiǎn)巫飨憬?；IB：香蕉套作白三葉草。不同字母表示處理間差異顯著（P＜0.05），下同。Fig. 1 The disease incidence of banana Fusarium wilt and relative abundance of Fusarium oxysporum in different treatmentsNote: MB: Banana monoculture; IB: Intercropping of banana with white clover. Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P＜0.05), similarly hereinafter.

2.2 套作白三葉草對(duì)連作蕉園土壤化學(xué)性質(zhì)的影響由表1可知，與單作香蕉處理（MB）相比，香蕉套作白三葉草處理（IB）土壤的速效磷含量、有機(jī)質(zhì)含量、銨態(tài)氮含量和硝態(tài)氮含量均降低(P＜0.05)，pH值和速效鉀含量增加(P＜0.05)。

表1 套作白三葉草對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Tab. 1 Effects of intercropping of banana with white clover on soil chemical properties

2.3 套作白三葉草對(duì)土壤微生物Alpha多樣性的影響從表2可知，相比于單作香蕉處理，套作白三葉草處理土壤真菌的豐富度和多樣性均顯著增加。細(xì)菌的Chao、Ace和Shannon指數(shù)在處理間的差異不顯 著，而Invsimpson指數(shù)顯著高于單作香蕉處理。

表2 土壤微生物的Alpha多樣性指數(shù)Tab. 2 Soil microbial alpha diversity indexes in different treatments

2.4 套作白三葉草對(duì)土壤微生物Beta多樣性的影響基于Bray-curits距離的主坐標(biāo)分析（圖2）結(jié)果表明，單作香蕉和套作白三葉草處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，第1和第2主坐標(biāo)軸分別解釋了總差異的41.90%和10.76%，單作香蕉和套作白三葉草處理沿第一軸（PCoA 1）明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖2a）。由圖2b可以看出，單作香蕉和套作白三葉草處理的真菌群落沿第一軸（PCoA 1）明顯區(qū)分開(kāi)，第一和第二主坐標(biāo)軸分 別解釋了總差異的55.01%和7.54%。

圖2 基于Bray-curits距離的細(xì)菌（a）和真菌（b）群落主坐標(biāo)分析Fig. 2 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterial (a) and fungal (b) community based on Bray-curits distance

2.5 套作白三葉草對(duì)土壤微生物群落組成的影響2個(gè)處理土壤微生物門(mén)水平組成的結(jié)果如圖3所示。由圖3-a可以看出，套作白三葉草（IB）和單作香蕉（MB）的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)（Proteobacteria）。與單作香蕉處理相比，套作白三葉草土壤的變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）相對(duì)豐度顯著增加；放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度顯著降低。由圖3-b可以看出，各處理真菌優(yōu)勢(shì)門(mén)為子囊菌門(mén)（Ascomycota），與單作香蕉相比，套作白三葉草土壤的擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）和接合菌門(mén)（Zygomycota）相對(duì)豐度增加；子囊菌門(mén)（Ascomycota）相對(duì)豐度降低。

圖3 細(xì)菌（a）和真菌（b）門(mén)的相對(duì)豐度注：MB：?jiǎn)巫飨憬?；IB：香蕉套作白三葉草。Fig. 3 The relative abundance of bacterial (a) and fungal (b) phyla Note: MB: Monoculture of banana; IB: Intercropping of banana with white clover.

用Venn圖來(lái)表示細(xì)菌、真菌在2個(gè)處理中共有OTU的數(shù)量，并計(jì)算其在總OTU里面所占的比例。單作香蕉（MB）土壤中，細(xì)菌和真菌OTU的數(shù)量分別為1 307個(gè)和628個(gè)。套作白三葉草（IB）土壤中有1 324個(gè)細(xì)菌保留OTU，667個(gè)真菌保留OTU。2個(gè)處理中共有的細(xì)菌和真菌OTU分別占總OTU數(shù)量的94.74%和88.22%（圖4）。

圖4 不同處理中土壤的細(xì)菌（a）和真菌（b）OTU分布Venn圖Fig. 4 The venn diagram of bacterial (a) and fungal (b) OTU distribution of soil in different treatments

2個(gè)處理土壤微生物屬水平組成的結(jié)果如圖5所示。由圖5-a可以看出，與單作香蕉處理相比，套作白三葉草處理土壤細(xì)菌的Desulfovirgula屬、Gp16、Gp6、Kofleria屬、硝化螺菌屬（Nitrospira）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、Spartobacteria和Syntrophorhabdus屬相對(duì)豐度增加，Bacillus屬、Gaiella屬、Gp1、Gp3、Gp4和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）相對(duì)豐度降低。

由圖5-b可以看出，相比于單作香蕉處理，套作白三葉草處理土壤真菌的Davidiella屬、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、支頂孢屬（Acremonium）、被孢霉屬（Mortierella）、梭孢殼屬（Thielavia）、阿太菌屬（Athelia）和黑團(tuán)孢屬（Periconia）相對(duì)豐度增加。而鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、盤(pán)菌屬（Peziza）、Naumovozyma屬、Cercophora屬和漆斑菌屬（Myrothecium）相對(duì)豐度降低。

圖5 各處理土壤細(xì)菌（a）和真菌（b）屬水平豐度圖Fig. 5 Relative abundance of the top 20 classified bacteria (a) and fungi (b) in the soil under different treatments

相對(duì)豐度較高的前20個(gè)細(xì)菌屬和真菌屬，分別與尖孢鐮刀菌做皮爾森相關(guān)性分析，篩選出具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的屬（表3）。其中，細(xì)菌屬的GP6、GP16、兔芽孢菌屬（Spartobacteria_genera_incertae_sedis）、Desulfovirgula菌、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、硝化螺菌屬（Nitrospira）、Syntrophorhabdus菌和Kofleria菌與尖孢鐮刀菌（Fusarium）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。真菌中，Davidiella菌、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、支頂孢屬（Acremonium）、被孢霉屬（Mortierella）、梭孢殼屬（Thielavia）、阿太菌屬（Athelia）和黑團(tuán)孢屬（Periconia）與尖孢鐮刀菌（Fusarium）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。

表3 土壤尖孢鐮刀菌與微生物屬水平相對(duì)豐度的Pearson相關(guān)性Tab. 3 Pearson correlation between the relative abundance of genera and Fusarium

由屬水平豐度圖（圖5）可以看出，GP16、Davidiella菌、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、支頂孢屬（Acremonium）、被孢霉屬（Mortierella）和阿太菌屬（Athelia）明顯在香蕉套作白三葉草處理的土壤中富集，且與尖孢鐮刀菌的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。

3 討 論

長(zhǎng)期連作種植和不合理的施肥方式導(dǎo)致蕉園地發(fā)生嚴(yán)重的連作障礙，土壤板結(jié)、土壤容重下降、土壤微生物群落失衡，進(jìn)而加劇了土傳病原菌的迅速繁殖[21]。病原菌的數(shù)量與香蕉枯萎病的發(fā)病率具有顯著正相關(guān)關(guān)系[22-23]。改善蕉園土壤微生物區(qū)系，降低尖孢鐮刀菌的數(shù)量是防控香蕉枯萎病的有效手段。本研究結(jié)果表明，套作白三葉草處理的枯萎病發(fā)病率和尖孢鐮刀菌相對(duì)豐度均顯著低于單作香蕉處理。因此，套作白三葉草對(duì)尖孢鐮刀菌有一定的抑制效果，能在一定程度上有效地防控香蕉枯萎病。

與單作香蕉處理相比，套作白三葉草處理顯著提高了土壤pH值和速效鉀含量(P＜0.05)，這與楊勁明等[24]的研究結(jié)果一致。很多報(bào)道認(rèn)為，土壤肥力水平很大程度上影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成，從而影響香蕉土傳枯萎病的發(fā)生[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果中，較高的土壤pH值和土壤速效鉀含量可能是抑制香蕉枯萎病的關(guān)鍵肥力因子。土壤pH值往往與枯萎病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這已被很多研究證實(shí)[27-28]。廖明莉等[29]利用4種豆科綠肥與小麥間作，發(fā)現(xiàn)4個(gè)綠肥品種均能顯著提高土壤中P2O5的含量，提高效應(yīng)達(dá)40.0%～50.9%。除此之外，植物與土壤微生物之間通過(guò)植物根系建立起密切聯(lián)系[30]。套作作物作用于土壤，其根系占據(jù)生態(tài)位，通過(guò)根系與土壤之間的物質(zhì)交換改變了土壤微生物生活的根際微環(huán)境，進(jìn)而影響了土壤微生物群落，甚至有些作物的根系分泌物中的化感物質(zhì)會(huì)抑制病原菌的生長(zhǎng)[31]。趙夢(mèng)麗等[32]通過(guò)研究擬南芥根系分泌物對(duì)土壤微生物群落組成和功能的影響時(shí)指出，根系分泌物可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加微生物中與養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)的功能基因的多樣性。在本試驗(yàn)中，Alpha多樣性分析結(jié)果表明，套作白三葉草處理?yè)碛懈叩恼婢鄻有院拓S富度。但是，對(duì)于細(xì)菌，只有InvSimpson指數(shù)顯著高于單作香蕉處理。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均沿第一主坐標(biāo)明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)。這種群落的顯著變化，可能是由于套作白三葉草后土壤微生物的生存環(huán)境變化所致[33]。因此，香蕉園套作白三葉草可以顯著改變部分肥力因子，并且改變土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。

不同處理土壤中細(xì)菌和真菌群落組成在門(mén)水平有明顯的差異。其中，高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)蕉園土壤中，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、真菌的優(yōu)勢(shì)門(mén)為子囊菌門(mén)（Ascomycota），且相比于單作香蕉處理，套作白三葉草處理顯著增加了細(xì)菌變形菌門(mén)的豐度，降低了真菌子囊菌門(mén)的豐度。研究證明，變形菌門(mén)具有抑制枯萎病的作用[34]，并且子囊菌門(mén)為大多數(shù)病原真菌所屬的門(mén)，很多研究指出，真菌子囊菌門(mén)的降低是香蕉土傳枯萎病發(fā)病率降低的重要特征[21,33]。因此，本試驗(yàn)中，變形菌門(mén)的增多和子囊菌門(mén)的降低也是導(dǎo)致套作白三葉草處理發(fā)病率降低的重要因素之一。韋恩分析結(jié)果顯示，套作白三葉草處理的細(xì)菌和真菌都出現(xiàn)了很多特有的OTU，表明套作白三葉草處理明顯改變了土壤微生物群落組成，并且優(yōu)勢(shì)屬水平的豐度圖表明，相比于單作香蕉處理，GP16、Davidiella等菌明顯在套作白三葉草處理的土壤中富集，相關(guān)性分析也證明這些菌與尖孢鐮刀菌都呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。有研究表明，酸桿菌門(mén)里一些屬的改變和土傳病害的發(fā)病率有較高的相關(guān)性[35]，本試驗(yàn)套作處理中GP16的富集，可能是屬水平上導(dǎo)致枯萎病病原菌數(shù)量和發(fā)病率降低的重要因素。

綜上所述，在蕉園中套作白三葉草可以改變部分土壤肥力指標(biāo)，改變土壤微生物的生存環(huán)境，重塑土壤微生物區(qū)系。套作白三葉草處理中病原菌相對(duì)豐度降低，土壤微生物多樣性提高，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成明顯改變，這可能是導(dǎo)致香蕉枯萎病發(fā)病率降低的主要原因。本試驗(yàn)結(jié)果可以為蕉園套作豆科綠肥防控香蕉枯萎病提供借鑒。