利用InDel標記進行啤酒大麥黃花葉病抗性鑒定

徐 肖，欒海業(yè)，楊紅燕，黃煜韜，張英虎，臧 慧，陶 紅，陳 和，陳 健，喬海龍，沈會權*

（1.江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇 鹽城 224001；2.江蘇天賦生物科技有限責任公司，江蘇 鹽城 224001）

大麥黃花葉病是由大麥黃花葉病毒（BaYMV）和大麥溫和花葉病毒（BaMMV）引起的土傳病害。大麥黃花葉病不但造成大麥減產，而且會降低籽粒品質[1]。我國長江中下游冬大麥產區(qū)是大麥黃花葉病的高發(fā)區(qū)，病田輕者減產30%～40%，重者顆粒無收。隨著全球氣候變暖，大麥適宜的生態(tài)區(qū)域增加，加上我國大型農機的大面積推廣和使用，大麥黃花葉病發(fā)病面積可能進一步增加。由于寄主和病原菌相互作用，協(xié)同進化，不斷產生出新的病毒株系，導致我國原有抗源材料單二、蘇啤6號等優(yōu)質啤酒大麥相繼喪失抗性[2]。因此，如何利用有效抗病基因快速選育抗大麥黃花葉病新品種，成為當前啤酒大麥生產上亟待解決的重要問題。

目前，我國大麥黃花葉病主要依靠大田或病圃進行表型鑒定，需大量人力、物力來進行多年多點多個時期的鑒定。病害發(fā)生的嚴重程度與當年氣候條件相關，年度間的病級不穩(wěn)定，導致鑒定結果具有一定差異。分子標記是在DNA水平上鑒定抗病基因，進行抗病性選擇時不受環(huán)境影響。利用分子標記輔助選擇（molecular marker-assisted selection，MAS）可實現(xiàn)抗病基因在品種選育中的快速應用，有助于在生產上合理布局抗病基因資源和延長抗病品種使用年限[3]。

我國大麥黃花葉病病毒存在6個不同的BaYMV株系（A1、A2、B1、B2、B3和B4）與1個BaMMV株系[4]，與日本的病毒株系有很高的相似度但又有所差異[5]。本研究利用InDel標記聚合法，對180份啤酒大麥資源進行檢測，結合表型鑒定，評價標記檢測的有效性，以期為選育啤麥抗黃花葉病新品種提供廣譜性抗性資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以收集的國內外200份啤酒大麥種質資源為材料，其中：80份由江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所提供，60份由揚州大學大麥研究所提供，60份由中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供。

1.2 田間種植

分別于2019年和2020年秋季將參試材料種植于江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所南洋試驗場（120.1614°E、33.3891°N）大麥黃花葉病病圃，采用隨機區(qū)組設計，每個材料播種1行，每行點播40粒，設3次重復。

1.3 表型抗性鑒定

次年2月至3月對參試材料抗病性進行調查和鑒定，每個材料連續(xù)調查10株，每隔7 d調查1期，連續(xù)調查4期。調查時期：2020年2月20日、2月27日、3月5日與3月12日，2021年2月24日、3月3日、3月10日、3月17日。參照黃培忠等的標準[6]進行抗性級別判定：1級（高抗）—葉片葉色正常，無黃花斑點；2級（抗?。~片葉色基本正常，有黃花斑點，但斑點未連成線；3級（感?。~片病斑的斑點連成線，葉片黃化，但植株不矮化；4級（高感）—葉片出現(xiàn)大片黃花病斑，葉片黃化，植株萎縮、矮化，趨于死亡。

1.4 分子標記

利用InDel標記JSB056與JSB060進行基因型檢測，其中：JSB056與rym5緊密連鎖，JSB060與rym1緊密連鎖；2個InDel標記均由徐婷婷等開發(fā)[7]。引物信息見表1，rym1與rym5的基本信息見表2[8-10]。

表1 InDel標記信息

表2 抗大麥黃花葉病基因的基本信息

1.5 自然群體基因型分析

采用CTAB法[11]提取參試材料DNA。利用PCR擴增技術鑒定參試材料基因型。PCR總體系為20 μL，包含1μL上下游引物（濃度為10μmol/L）、2 μL 10×PCR Buffer、13.4μL ddH2O、2μL MgCl2(Mg2+20 mmol/L)、0.4μL DNTPs（濃度為10μmol/L）、0.2 μLTaq酶（濃度為2.5 U/μL）、模板DNA 1μL（濃度為50 ng/μL）。PCR擴增程序為：預變性94℃5 min；變性94℃45 s，退火55℃45 s，延伸72℃45 s，共進行35個循環(huán)；再延伸72℃10 min，12℃保存?zhèn)溆?。以瓊脂糖凝膠（2%）上電泳分離PCR擴增產物，經溴化乙錠（EB）染色，在凝膠成像儀照相、記錄，以木石港3號為對照，其帶型記為“A”，其余帶型記為“B”，進行基因型分型統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 自然群體的黃花葉病抗性

取每年度4個時期發(fā)病病級最高值作為本年度自然群體200份啤酒大麥種質資源黃花葉病抗性鑒定結果，2年數(shù)據(jù)表明，均表現(xiàn)為抗病的有37份材料，均表現(xiàn)為感病的有143份材料，20份在年份間表現(xiàn)不穩(wěn)定的材料予以剔除。用于基因型鑒定的啤酒大麥種質資源共180份，啤酒大麥名稱及表型抗性信息見表3。

2.2 分子標記鑒定及其準確性

以木石港3號為對照，利用InDel標記JSB056與JSB060對180份啤酒大麥進行基因型鑒定，即與木石港3號帶型一致為抗性材料，其余均為感病材料。結果分析表明，JSB056與JSB060的基因型與表現(xiàn)型符合率分別為80.6%和77.8%。由表3可知，聚合2個標記，抗病種質的檢測率（檢測率=JSB056與JSB060均為抗病基因型材料數(shù)/抗病表現(xiàn)型材料數(shù)×100%）為91.9%。

表3 180份啤酒大麥名稱及大麥黃花葉病表型抗性信息

JSB056是rym5的連鎖分子標記，JSB060是rym1的連鎖分子標記。單純利用JSB056與JSB060均可在自然群體中鑒定大麥黃花葉病抗病材料，但檢測效率不高。聚合2個標記，可使檢測率高達91.9%。由于rym5與rym1是國內外應用較多的大麥黃花葉病抗性基因，對我國大麥黃花葉病病毒株系具有一定的抗性，因此聚合使用JSB056與JSB060對抗大麥黃花葉病材料檢測效果較好，可用于大麥抗黃花葉病的分子輔助選擇育種。

標記JSB056的PCR擴增帶型見圖1，擴增帶型清晰度較高，無雜帶，進一步說明了InDel標記穩(wěn)定性強。

圖1 InDel標記JSB056在部分啤酒大麥資源中的檢測結果

3 討論與結論

迄今，已報道出21個正式命名的大麥黃花葉病抗性基因，隨著大麥黃花葉病病毒生理小種的不斷變異，如單二等生產上大面積種植的品種大麥黃花葉病抗性也逐漸喪失。聚合不同抗病基因至同一品種中，提高品種抗性的同時，也能延長其使用年限，是解決生產上抗病問題的有效措施[12]。目前，國內外已獲得大量與抗大麥黃花葉病相關的分子標記，除少數(shù)克隆基因已經獲得共分離標記外，其他分子標記是在特定的遺傳背景下基于特定的遺傳群體進行定位而獲得的，在應用于抗病性育種時需要使用不同遺傳背景的分離群體來驗證其緊密連鎖分子標記的有效性。

DNA分子標記鑒定方法不受環(huán)境因素、植物不同發(fā)育階段不平衡等影響。最普遍用于大麥品種鑒定的DNA分子標記為簡單重復序列（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。王艷平等利用28個SSR引物對29份大麥資源進行基因型檢測，將不同穗棱型品種聚為一類[13]。朱彩梅等利用50個SSR標記對76份糯大麥進行聚類，結果表明種群劃分與皮裸性和地理分布有關[14]。張利莎等將SSR標記與EST技術相結合，定性檢測了4種大麥麥芽混合后混雜度高于10%的麥芽樣品；利用SNP標記與KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR）技術相結合，鑒定了混雜度低至5%的麥芽樣品[15]。Pattemore等利用45個SNP位點對大麥品種進行基因分型,生成了每個參試材料SNP標記獨特的條形碼[16]。徐東東等利用SNP標記進行麥芽品質分析，有效地鑒定了品種真實性及麥芽純度[17]。

SSR與SNP作為最常使用的分子標記，SSR分子標記具有共顯性與穩(wěn)定性的優(yōu)點，且標記成本低，應用技術簡單。SSR標記的缺點是在基因型鑒定過程中會出現(xiàn)帶型雜亂、模糊或帶型丟失等現(xiàn)象，導致基因型錯誤判別的概率增加。SNP分子標記分布廣泛、數(shù)量眾多，且是二態(tài)性分子標記，其具有檢測速度快、自動化水平較高等優(yōu)點，但由于大麥基因組序列較大，使得開發(fā)出的SNP分子標記在利用過程中需要花費大量人力物力，導致成本較高。二態(tài)性InDel標記具有共顯性、穩(wěn)定性高與多態(tài)性高等優(yōu)點，通過PCR擴增技術及瓊脂糖凝膠電泳即可進行基因分型，且擴增帶型清晰度與準確性很高。

rym5與rym1是全球應用較多的大麥黃花葉病抗性基因，本研究表明利用InDel標記鑒定大麥黃花葉病抗性可獲得理想的篩選效果。為獲得更高的分子標記選擇效率，還需進一步定位新的抗病基因，開發(fā)出與其緊密連鎖的分子標記，從而篩選出聚合多個抗病基因的抗源，培育出抗黃花葉病啤酒大麥新品種。