鞣花酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方優(yōu)化和口服生物利用度研究

王小霞，張智強(qiáng)

鞣花酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方優(yōu)化和口服生物利用度研究

王小霞1，張智強(qiáng)2*

1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000 2. 天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，天津 300301

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鞣花酸（EA）納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（EA-NLC）處方，并進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。采用乳化超聲法制備EA-NLC。以包封率、載藥量和粒徑為考察指標(biāo)，采用單因素考察和Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化EA-NLC的處方。對(duì)最佳處方進(jìn)行表征，并比較體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為。最佳處方為脂-藥比為13.7∶1、固-液脂質(zhì)比為4.4∶1、泊洛沙姆188的用量為1.2%。EA-NLC包封率為（85.06±0.48）%，載藥量為（5.53±0.15）%，粒徑為 （166.5±4.6）nm。體外釋藥具有明顯的緩釋特征，釋藥過程符合Weibull模型：lnln[1/(1－M/∞)]＝0.682 1 ln－2.028 4，＝0.982 7。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，EA-NLC的達(dá)峰時(shí)間（max）、半衰期（1/2）、達(dá)峰濃度（max）、時(shí)間-曲線下面積 （AUC0～和AUC0～∞）等主要參數(shù)與原料藥相比均有顯著性差異（＜0.05、0.01），將鞣花酸口服吸收生物利用度提高至4.67倍。Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所建立的模型能較好地用于EA-NLC處方優(yōu)化，準(zhǔn)確度高，預(yù)測(cè)效果較好，且EA-NLC顯著增加了EA口服吸收生物利用度。

鞣花酸；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；藥動(dòng)學(xué)；Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；緩釋特征；口服生物利用度

鞣花酸（ellagic acid，EA）是一種天然多酚二內(nèi)酯，主要存在于堅(jiān)果及中藥材中，研究表明[1-4]，鞣花酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、消炎、調(diào)節(jié)雌激素分泌、抗纖維化等活性，但屬于生物藥劑學(xué)IV類藥物[5]，在25 ℃水中表觀溶解度僅為0.015 mg/mL[6]，口服吸收較差[7]，從而影響藥效發(fā)揮。因此，提高鞣花酸的生物利用度具有較大意義，目前，鞣花酸納米制劑有殼聚糖納米粒[8]、聚合物納米粒[7]等研究報(bào)道，但存在包封率及載藥量低等缺陷。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLC）是從固體納米粒技術(shù)改良發(fā)展而來，除了固態(tài)脂質(zhì)外，增加液態(tài)脂質(zhì)共同作為納米載體而制備的一種納米給藥系統(tǒng)。液態(tài)脂質(zhì)載體打亂了固態(tài)脂質(zhì)的晶格，增加了包裹藥物的能力，因而提高了納米制劑的包封率及載藥量，避免在儲(chǔ)存過程在藥物泄露等問題。該技術(shù)可有效增加藥物的溶解度及溶出度、改變藥物體內(nèi)分布、促進(jìn)藥物吸收、提高生物利用度，最終為提高藥效奠定基礎(chǔ)[9-12]。本研究對(duì)鞣花酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（EA-NLC）處方工藝進(jìn)行研究，采用EA-NLC的包封率（1）、載藥量（2）和粒徑（3）為響應(yīng)值，選擇脂質(zhì)與藥物用量比例（1）、固態(tài)與液態(tài)脂質(zhì)比例（2）、泊洛沙姆188的用量（3）為主要影響因素，通過采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法[13]期望得到具有理想包封率、載藥量和粒徑的EA-NLC。進(jìn)一步制備成EA-NLC凍干粉，考察穩(wěn)定性及藥物體外釋藥。以鞣花酸原料藥為參考，研究體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)情況，為鞣花酸納米制劑研究提供參考。

1 儀器與材料

FA2004B型電子天平，感量為0.01 mg，上海精科科學(xué)儀器有限公司；RC-6D型溶出儀，天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造股份有限公司；1200型高效液相色譜儀（HPLC），二極管陣列檢測(cè)器，美國Agilent公司；DBF-86V50型超低溫冰箱，山東博科科學(xué)儀器有限公司；ZNCL-S-5D型多點(diǎn)數(shù)顯磁力攪拌器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；HN10-260B型實(shí)驗(yàn)室用雙頻超聲儀，上海汗諾儀器有限公司；Master-sizer型粒度分析儀，英國馬爾文儀器公司；FD-1A-50型真空凍干機(jī)，杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

鞣花酸對(duì)照品，批號(hào)P200215，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%，上海原葉生物科技公司；鞣花酸原料藥，批號(hào)191205003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，河南萊爾茵生物科技有限公司；辛酸/癸酸甘油三酯（Miglyol?812），批號(hào)161105T，上海特伯化學(xué)科技有限公司；泊洛沙姆188，批號(hào)WPEE587E，德國巴斯夫有限公司；D36 mm型透析袋，截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～ 14 000，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；單硬脂酸甘油酯，批號(hào)190915，德國巴斯夫有限公司；其他試劑均為分析純。

清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（260±20）g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證SCXK（豫）2016- 0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Angilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（45∶55）；檢測(cè)波長為254 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。理論塔板數(shù)以鞣花酸計(jì)不低于10 000，色譜圖見圖1。鞣花酸對(duì)照品質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL（圖1-B），EA-NLC供試品樣品質(zhì)量濃度為13.3 μg/mL（圖1-C）。

2.1.2 供試品溶液的配制 采用超聲破乳法制備供試品溶液。精密量1 mL的EA-NLC轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲5 min，得澄清溶液，放置30 min，加入甲醇-0.1%磷酸水溶液（45∶55）定容，即得EA-NLC的供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制及線性關(guān)系考察 精密稱取鞣花酸對(duì)照品20 mg，置于50 mL量瓶中，加入30 mL甲醇超聲5 min，放置30 min后甲醇定容，得0.4 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。采用流動(dòng)相配制40.00、20.00、10.00、5.00、0.50、0.05 μg/mL的鞣花酸對(duì)照品溶液，進(jìn)HPLC。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為＝19.912 7－0.810 4，＝0.999 7，鞣花酸線性范圍為0.05～40.00 μg/mL。

圖1 空白溶劑(A)、鞣花酸對(duì)照品(B)和EA-NLC樣品(C)溶液的HPLC圖

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同1份EA-NLC，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法分別處理6份供試品溶液，進(jìn)HPLC分析，計(jì)算鞣花酸含量。結(jié)果顯示鞣花酸質(zhì)量濃度的RSD值為1.06%，說明方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同1份EA-NLC供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)HPLC分析。結(jié)果顯示鞣花酸峰面積的RSD值為1.30%，說明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.05、10.00、40.00 μg/mL的鞣花酸對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)HPLC測(cè)定6次。結(jié)果顯示鞣花酸峰面積的RSD值分別為0.39%、0.14%、0.17%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9份1 mL的EA-NLC供試品溶液，每組3份，分為3組，分別加入標(biāo)示量1.2、1.6、2.0 mL的鞣花酸對(duì)照品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法操作制備EA-NLC供試品溶液，進(jìn)HPLC分析，計(jì)算鞣花酸含量和加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.62%，RSD為1.65%，表明該方法學(xué)準(zhǔn)確度較高。

2.2 EA-NLC的制備

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)曾考慮乳化法制備EA-NLC，但該法表面活性劑用量較大，故采用乳化超聲法制備EA-NLC。固定鞣花酸用量為40 mg，分別取處方量的固態(tài)脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯和液態(tài)脂質(zhì)至三角瓶中，加入15 mL無水乙醇。于轉(zhuǎn)速為1000 r/min、溫度為65 ℃水浴中加熱溶解得油相。固定水相體積為60 mL，加入處方量的泊洛沙姆188，于1000 r/min轉(zhuǎn)速條件下，65℃水浴加熱攪拌溶解。將水相加至油相，持續(xù)攪拌1.5 h得初乳，在一定功率下超聲一定時(shí)間（工作3 s間隔2 s），立即于?15℃冰箱固化15 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得EA-NLC。

2.3 包封率、載藥量、粒徑及Zeta電位的測(cè)定

量取1 mL的EA-NLC至超濾管中，14 500 r/min離心45 min（溫度為?4 ℃），HPLC測(cè)定續(xù)濾液中游離藥物質(zhì)量濃度，計(jì)算含量（游離）。另取1 mL的EA-NLC轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲5 min，得澄清溶液，放置30 min，加入甲醇- 0.1%磷酸水溶液（45∶55）定容，HPLC測(cè)定鞣花酸質(zhì)量濃度，計(jì)算鞣花酸總含量（總）。根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[11]計(jì)算包封率和載藥量。取EA-NLC混懸液0.2 mL，采用蒸餾水按照1∶20稀釋，取約3.5 mL置于比色皿中，并測(cè)定EA-NLC的粒徑和Zeta電位。

2.4 EA-NLC單因素考察

2.4.1 液態(tài)脂質(zhì)種類及比例考察 固定鞣花酸用量為40 mg，藥脂比為1∶15，單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，固液比為4∶1，表面活性劑泊洛沙姆188用量為1%，功率為250 W，超聲15 min條件下，分別考察不同液態(tài)脂質(zhì)種類及比例對(duì)EA-NLC的包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表1。液態(tài)脂質(zhì)種類及比例對(duì)包封率和載藥量有一定影響。單獨(dú)使用Miglyol?812時(shí)，EA-NLC的包封率、載藥量及粒徑大小均優(yōu)于油酸，兩者合用時(shí)雖然包封率及載藥量無明顯差別，但粒徑偏大，故選擇單獨(dú)使用Miglyol?812作為液態(tài)脂質(zhì)。

表1 液態(tài)脂質(zhì)種類及比例的考察(, n = 3)

2.4.2 固-液脂質(zhì)比例考察 固定鞣花酸用量為40 mg，藥脂比為1∶15，單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，Miglyol?812為液態(tài)脂質(zhì)，表面活性劑泊洛沙姆188用量為1%，功率為250 W，超聲15 min條件下，分別考察不同固-液脂質(zhì)比例對(duì)EA-NLC包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表2。固液脂質(zhì)比對(duì)包封率、載藥量和粒徑大小3個(gè)考察指標(biāo)均有較大影響。當(dāng)液態(tài)脂質(zhì)比例逐漸減小，固態(tài)脂質(zhì)比例逐漸增加時(shí)，對(duì)3個(gè)指標(biāo)產(chǎn)生積極影響。但液態(tài)脂質(zhì)比例不可過低，否則會(huì)影響包封率及載藥量。最終考慮選擇固-液脂質(zhì)比例3∶1、4∶1、5∶1繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.3 脂-藥比例考察 固定鞣花酸用量為40 mg，單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，Miglyol?812為液態(tài)脂質(zhì)，固-液脂質(zhì)比例為4∶1，表面活性劑泊洛沙姆188用量為1%，功率為250 W，超聲15 min條件下，分別考察不同藥-脂比對(duì)EA-NLC包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表3。不同脂-藥比對(duì)這3個(gè)考察指標(biāo)影響較大，由于脂-藥比為1∶25時(shí)包封率增加不明顯，載藥量反而下降幅度較大，且粒徑有所上升，故后期選擇脂-藥比1∶10、1∶15、1∶20進(jìn)行處方優(yōu)化。

表2 固-液脂質(zhì)不同比例的考察(, n = 3)

2.4.4 表面活性劑用量考察 固定鞣花酸用量為40 mg，單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，Miglyol?812為液態(tài)脂質(zhì)，固-液脂質(zhì)比例為4∶1，脂-藥比為1∶15，功率為250 W，超聲15 min條件下，分別考察不同泊洛沙姆188用量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對(duì)EA-NLC包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表4。粒徑隨著表面活性劑用量增加而逐漸減小。在一定范圍內(nèi)，包封率和載藥量隨著表面活性劑用量的增加而增加，但過大時(shí)反而出現(xiàn)下降，可能是表面活性劑增溶作用使藥物進(jìn)入水相所致。由于過高的表面活性劑用量可能使制劑存在一定的安全隱患[14]，故考慮選擇0.5%、1.0%、1.5%進(jìn)行繼續(xù)優(yōu)化。

表3 不同脂-藥比例的考察(, n = 3)

表4 表面活性劑用量的考察(, n = 3)

2.4.5 超聲功率考察 固定鞣花酸用量為40 mg，單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，Miglyol?812為液態(tài)脂質(zhì)，固-液脂質(zhì)比例為4∶1，脂-藥比為1∶15，表面活性劑泊洛沙姆188用量為1%，超聲15 min條件下，考察不同超聲功率來考察對(duì)EA-NLC包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表5。在功率200 W時(shí)粒徑較大，功率為350 W時(shí)，包封率和載藥量出現(xiàn)下降、粒徑反而增大。由于功率為300 W時(shí)EA-NLC的包封率、載藥量和粒徑大小均優(yōu)于250 W，因此，最終選擇超聲功率為300 W。

2.4.6 超聲時(shí)間考察 固定鞣花酸-用量為40 mg，單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，Miglyol?812為液態(tài)脂質(zhì)，固-液脂質(zhì)比例為4∶1，脂-藥比為1∶15，表面活性劑泊洛沙姆188用量為1%，超聲功率為300 W的條件下，分別考察超聲時(shí)間對(duì)EA-NLC包封率、載藥量和粒徑的影響，結(jié)果見表6。超聲時(shí)間過長或過短均會(huì)則影響EA-NLC的包封率和載藥量，且超聲時(shí)間過短時(shí)EA-NLC的粒徑較大。綜合考慮選擇超聲時(shí)間為15 min。

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化EA-NLC的處方

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 包封率、載藥量和粒徑是NLC的重要指標(biāo)，故作為響應(yīng)參數(shù)來優(yōu)化EA-NLC處方。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察情況，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)與藥物用量比例（1）、固態(tài)與液態(tài)脂質(zhì)比例（2）、泊洛沙姆188的用量（3）對(duì)包封率（1）、載藥量（2）和粒徑（3）影響較大，因此，選擇該3個(gè)因素進(jìn)行處方優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表7。以總評(píng)分（OD）為響應(yīng)指標(biāo)，計(jì)算過程為①包封率、載藥量和粒徑進(jìn)行歸一化處理，其中包封率（1）和載藥量（2）越大越好［＝(M－min)/(max－min)］，粒徑（3）越小越好 ［＝(max－M)/(max－min)］，其中M為測(cè)量值，max和min為所有試驗(yàn)中最大值和最小值。②將1、2和3進(jìn)行歸一化處理，即總評(píng)分OD＝(123)1/3。結(jié)果見表7。

表5 超聲功率的影響(, n = 3)

表6 超聲時(shí)間的影響(, n = 3)

2.5.2 模型的建立和顯著性分析 采用Design Expert V8.0.6軟件進(jìn)行擬合，OD二次多元回歸方程為OD＝0.76－0.0361＋0.0942＋0.113－0.1212＋0.1113＋0.1723－0.3612－0.1922－0.2432。模型的＝0.002 9＜0.01，說明模型具有極顯著性意義，失擬項(xiàng)＝0.170 0＞0.05，說明未知因素對(duì)模型干擾很小。另外模型的2＝0.939 5，adj2＝0.906 9，說明模型與實(shí)際吻合度良好，因此，可以采用此模型對(duì)EA-NLC處方進(jìn)行研究，可信度較高。檢驗(yàn)結(jié)果見表8。模型中2、3、12、22和32均顯著或極顯著（＜0.05、0.01），影響順序?yàn)?＞2＞1，但其他交互因素不顯著。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表8 方差分析

2.5.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)得出的二次多元回歸方程，采用Design Expert V8.0.6繪制因變量對(duì)自變量的三維曲面圖。分別固定脂質(zhì)與藥物用量比例（1）、固態(tài)與液態(tài)脂質(zhì)比例（2）、泊洛沙姆188的用量（3）因素中之一，得到其他2個(gè)因素對(duì)總評(píng)分OD的影響，結(jié)果見圖2。

根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果得到的最佳處方為藥物用量比例為13.7∶1、固態(tài)與液態(tài)脂質(zhì)比例為4.4∶1、泊洛沙姆188的用量為1.2%，OD值為0.787 1。包封率預(yù)測(cè)值為85.47%，載藥量預(yù)測(cè)值為5.61%，粒徑預(yù)測(cè)值為169.6 nm。

按照此處方平行制備3批EA-NLC，測(cè)得包封率為（85.06±0.48）%，載藥量為（5.53±0.15）%，粒徑為（166.5±4.6）nm（圖3，強(qiáng)度徑），分別與預(yù)測(cè)值較為接近。另測(cè)得EA-NLC的Zeta電位為（?36.1±3.8）mV，見圖4，其絕對(duì)值大于30。

圖2 各因素與響應(yīng)值的三維圖

圖3 EA-NLC粒徑分布

圖4 EA-NLC的Zeta電位

2.6 凍干粉的制備

取EA-NLC混懸液加入凍干劑（設(shè)置不同種類及用量），混勻，置于?60 ℃超低溫冰箱預(yù)凍48 h。迅速置于?30℃冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥72 h，于6 h內(nèi)緩慢升溫至25℃，并保持3 h，取出即得凍干粉末。蔗糖作為凍干劑時(shí)效果往往較差，故不再考察。分別選擇乳糖、海藻糖及甘露醇作為凍干劑，并分別設(shè)置3%、5%、7%的用量。制得EA-NLC凍干粉后按表10進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]，得分結(jié)果見表11，最終選擇得分最高的用量為5%甘露醇作為凍干保護(hù)劑。復(fù)溶后測(cè)得包封率為（80.02±0.52）%，載藥量為（5.07±0.17）%，Zeta電位為（30.3±2.7）mV，粒徑為（228.2±8.6）nm。EA-NLC混懸液、EA-NLC凍干粉及復(fù)溶后樣品見圖5。

2.7 EA-NLC凍干粉穩(wěn)定性考察

取EA-NLC混懸液置于干燥器中（室溫，避光），分別于0、1、3、5、7、14、21、30 d取樣0.2 mL，采用蒸餾水按照1∶20稀釋，取約3.5 mL置于比色皿中分別測(cè)定粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。取EA-NLC凍干粉置于相同條件，分別于相同時(shí)間取相當(dāng)于0.2 mL的EA-NLC混懸液凍干粉，加入0.2 mL蒸餾水復(fù)溶，并按照1∶20稀釋，取約3.5 mL置于比色皿中分別測(cè)定凍干粉中EA-NLC粒徑和PDI，結(jié)果見表12。EA-NLC混懸液在30 d內(nèi)的粒徑及PDI均呈現(xiàn)增大趨勢(shì)；而制備成凍干粉后粒徑及PDI變化幅度較小，說明EA- NLC凍干粉穩(wěn)定性優(yōu)于EA-NLC混懸液。

表10 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表11 考察結(jié)果(n = 3)

圖5 EA-NLC樣品外觀圖

表12 不同樣品在放置不同時(shí)間后的粒徑和PDI(, n = 3)

2.8 體外釋藥行為研究及模型擬合

取適量EA-NLC凍干粉（含10.0 mg的鞣花酸），加入3 mL的釋放介質(zhì)配制混懸液，轉(zhuǎn)移至透析袋中，另取含10 mg的鞣花酸溶液置于透析袋，扎緊兩端。釋放介質(zhì)為1000 mL的pH 6.8磷酸鹽緩沖液，溫度和轉(zhuǎn)速分別為（37±1）℃和100 r/min。分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h分別取樣3 mL，并補(bǔ)液3 mL。各樣品均過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)HPLC測(cè)定，結(jié)果見圖6。鞣花酸原料藥在6 h內(nèi)釋藥較快，累積釋放度為96.5%，基本釋放完全。而EA-NLC在前8 h釋放相對(duì)較快，在8～36 h則表現(xiàn)出明顯的緩釋作用。釋藥機(jī)制擬合結(jié)果見表13，EA-NLC與Weibull模型：lnln[1/(1－M/∞)]＝0.682 1 ln－2.028 4（＝0.982 7）擬合程度最高。

2.9 口服藥動(dòng)學(xué)比較

2.9.1 實(shí)驗(yàn)方案 取適量的鞣花酸原料藥、鞣花酸與輔料的物理混合物和EA-NLC凍干粉末，用0.5% CMC-Na溶液配制ig液，鞣花酸質(zhì)量濃度均為10 mg/mL。灌胃液均呈混懸狀態(tài)，可順利通過灌胃針。

圖6 體外釋放曲線(n = 6)

表13 藥物釋放模型和相關(guān)系數(shù)

∞為￥時(shí)累積釋放度；M為時(shí)間累積釋放度；M/∞為時(shí)間累積釋放百分率；為時(shí)間

∞is accumulative drug-release at time￥,Mis accumulative drug- release at time,M/∞is accumulative release rate at time,is time

取健康SD大鼠18只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。大鼠隨機(jī)分為原料藥組、物理混合物組和凍干粉末組，按照100 mg/kg進(jìn)行單劑量單次給藥。于0.167、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h時(shí)間點(diǎn)，分別取各組大鼠，3人同時(shí)采用乙醚麻醉大鼠，同時(shí)眼眶取血0.2～0.3 mL，立即棉球止血。將采到的血樣置于肝素抗凝的離心管中，作好標(biāo)記后分別渦旋5 s，3000 r/min離心3 min，分離血漿后保存在?15 ℃冰箱。

2.9.2 血漿樣品處理過程 參考文獻(xiàn)方法[16-17]，略作改進(jìn)。取甲醇20 mL和乙腈100 mL超聲混勻后作為蛋白沉淀劑及鞣花酸提取液。血漿樣品解凍后取100 μL至離心管中，加入150 μL 1 mol/L KH2PO4和15 μL 50%磷酸水溶液，渦旋混合5 min，繼續(xù)加入提取液1 mL并渦旋混合5 min，5000 r/min離心5 min，收集上清液。繼續(xù)加入0.3 mL提取液洗滌沉淀，同法操作。合并2次上清液，45 ℃的N2吹干，加入100 μL甲醇復(fù)溶后進(jìn)樣測(cè)定。

2.9.3 線性關(guān)系考察 取鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，甲醇稀釋至1500、1000、500、100、50、25 ng/mL。各種質(zhì)量濃度分別取100 μL，N2緩慢吹干得殘?jiān)?，分別加入100 μL空白血漿，密封，作好標(biāo)記，依次渦旋5 min。按照“2.9.2”方法處理，進(jìn)樣分析。以鞣花酸峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝0.011 5＋0.091 2，＝0.994 1，因此血漿對(duì)照品線性范圍為25～1500 ng/mL。

2.9.4 方法學(xué)驗(yàn)證 取空白血漿、血漿對(duì)照品溶液和血漿樣品溶液，按照“2.9.2”項(xiàng)方法處理，進(jìn)樣分析，典型色譜圖見圖7，可見專屬性較高，其中鞣花酸＋空白血漿中鞣花酸質(zhì)量濃度為25 ng/mL，血漿樣品中鞣花酸質(zhì)量濃度為40.37 ng/mL（EA- NLC ig后12 h的血漿樣品）。

取處理后的血漿樣品于0、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣，計(jì)算鞣花酸峰面積的RSD為4.03%，因此穩(wěn)定性良好。取質(zhì)量濃度為25 ng/mL（低）、500 ng/mL（中）和1500 ng/mL（高）血漿對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，鞣花酸峰面積的RSD依次為4.64%、3.71%、2.03%，可見，日內(nèi)密度度良好。各質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣6 d，每天1次，計(jì)算鞣花酸峰面積的RSD依次為7.24%、4.08%、5.23%，可見日間精密度良好。

圖7 空白血漿(A)、鞣花酸＋空白血漿(B) 和血漿樣品(C) 的HPLC圖

空白血漿配制25、500、1500 ng/mL的血漿樣品，各種質(zhì)量濃度分別制備3份并按照“2.9.2”項(xiàng)方法處理，進(jìn)HPLC測(cè)定峰面積，按照方程＝0.011 5＋0.091 2計(jì)算測(cè)定質(zhì)量濃度，并與配制質(zhì)量濃度相比計(jì)算回收率。低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率依次為92.07%、89.36%、94.87%，RSD依次為6.04%、3.25%、4.09%，所以回收率較高。

取0.25 ng/mL的血漿對(duì)照品溶液，逐步稀釋，鞣花酸定量限（信噪比S/N＝3）為3.0 ng/mL，鞣花酸檢測(cè)限（S/N＝10）為1.5 ng/mL。

2.9.5 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 藥-時(shí)曲線見圖8。采用3P97軟件處理藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，達(dá)峰時(shí)間（max）和半衰期（1/2）采用非參數(shù)法秩和檢驗(yàn)，達(dá)峰濃度（max）和時(shí)間-曲線下面積（AUC）經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，結(jié)果見表14，鞣花酸及EA-NLC均符合二室房室模型。

EA-NLC的max、1/2、max、AUC0～t和AUC0～∞等參數(shù)與鞣花酸原料藥相比均有顯著性差異（＜0.05、0.01），其中max由（0.96±0.22）h延后至 （2.32±0.36）h，1/2由（2.11±0.31）h延長至 （5.63±0.94）h，max提高至3.52倍，清除率（CL）下降至（34.61±5.82）mL/(h×kg)，說明NLC極大改變了鞣花酸原料藥的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程，顯著延長了藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，促進(jìn)了藥物體內(nèi)吸收，相對(duì)口服吸收生物利用度提高至4.67倍。物理混合物組的max、AUC0～t和AUC0～∞等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與原料藥相比雖有一定程度提高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

圖8 藥-時(shí)曲線(n = 3)

表14 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 3)

與鞣花酸比較：*＜0.05**＜0.01；與物理混合物比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01ellagic acid;#<0.05##<0.01physical mixture

3 討論

分離納米藥物和游離藥物對(duì)測(cè)定包封率和載藥量至關(guān)重要。課題組曾采用14 500 r/min高速離心40 min后仍未達(dá)到有效分離，可能是由于EA-NLC處方中加入了密度較小的液態(tài)脂質(zhì)所致。由于凝膠柱色譜法不僅操作較為繁瑣，且可能會(huì)對(duì)NLC產(chǎn)生吸附作用[18]，進(jìn)而會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。因此選用超濾法來測(cè)定EA-NLC包封率和載藥量。

為了提高EA-NLC的穩(wěn)定性，本研究進(jìn)一步制備成了凍干粉，其過程是一個(gè)非常復(fù)雜的相變過程。經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)，5%甘露醇作為凍干劑時(shí)效果最佳，可最大程度發(fā)揮骨架支撐作用。這可能是由于在凍干過程中甘露醇結(jié)構(gòu)中的OH?與NLC表面形成氫鍵[19]，從而在脫水過程中與水進(jìn)行交換，有助于維持NLC的微觀結(jié)構(gòu)，抑制NLC聚集。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法具有精確度高、結(jié)果可靠性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在處方篩選中應(yīng)用較多，本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法得到EA-NLC最佳處方工藝，其包封率、載藥量及粒徑的預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值較為接近。EA-NLC體外釋藥包含快速釋藥階段（0～6 h）和緩釋階段（6～36 h）?？焖籴屗庪A段可能與NLC吸附方式載藥有關(guān)[18]，藥物由于表面活性劑的作用主要分布在NLC表面乳化層、納米粒子的淺表層或表層，釋藥相對(duì)容易，因而出現(xiàn)快速釋藥階段。緩釋階段可能是由于藥物分散于液態(tài)脂質(zhì)、固態(tài)脂質(zhì)或固-液脂質(zhì)形成的晶體缺陷空間，藥物釋放出去需經(jīng)過的屏障較多，因而出現(xiàn)緩慢釋藥階段。

在血漿樣品處理時(shí)難免造成藥物損失，因而一般采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行含量分析。楊媛等[16]研究結(jié)果顯示鞣花酸在酸性條件下提取效率最高，且本研究的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在酸性條件下采用外標(biāo)法[7,16-17]來測(cè)定鞣花酸含量時(shí)不僅專屬性較高，內(nèi)源性物質(zhì)不對(duì)鞣花酸色譜峰產(chǎn)生干擾，回收率滿足《中國藥典》2020年版四部9012項(xiàng)下對(duì)生物樣品分析的要求?？赡苁怯捎谠谒嵝詶l件下更有利于鞣花酸進(jìn)入有機(jī)溶劑中而被高效提取出來。外標(biāo)法處理較為簡單、快速，故采用酸性條件下的外標(biāo)法對(duì)鞣花酸血漿樣品進(jìn)行含量測(cè)定。

鞣花酸及其NLC的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，max發(fā)生顯著性延后，可能與EA-NLC具有緩釋特征有關(guān)。也可能由于EA-NLC粒徑較小，容易黏附于胃腸道，甚至進(jìn)入絨毛間隙，增加了在胃腸道的滯留時(shí)間，從而使max發(fā)生顯著性延后。生物利用度的提高可能是由于NLC粒徑較小，增加了與胃腸道接觸面積；1/2延長至（5.63±0.94）h，CL下降至（34.61±5.82）mL/(h×kg)，明顯增加了藥物體循環(huán)時(shí)間，有助于藥物被充分吸收[20-21]；NLC可在淋巴結(jié)構(gòu)Peyer’s parches中聚集，經(jīng)M細(xì)胞吸收進(jìn)入體循環(huán)，使藥物被高效吸收[22-23]；NLC處方中的非離子表面活性劑泊洛沙姆188可提高胃腸道黏膜的通透性[24]，最終使鞣花酸的口服吸收生物利用度提高至4.67 倍[25-27]。接下來將研究重點(diǎn)放在注射給藥的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)評(píng)價(jià)等，進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為EA-NLC提供更為全面的研究資料。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Ortiz-Ruiz C V, Berna J, Tudela J,. Action of ellagic acid on the melanin biosynthesis pathway [J]., 2016, 82(2): 115-122.

[2] Abdelazeem K N M, Singh Y, Lang F,. Negative effect of ellagic acid on cytosolic pH regulation and glycolytic flux in human endometrial cancer cells [J]., 2017, 41(6): 2374-2382.

[3] 于婭, 李利民, 潘嘉, 等. 鞣花酸抗S180, H22腫瘤及其抑制新生血管機(jī)制探討 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(8): 145-150.

[4] 韓奇亨, 張春紅, 龔雪, 等. 鞣花酸類化合物在野牡丹科植物中的分布與藥理活性研究 [J]. 中藥材, 2018, 41(12): 2962-2967.

[5] Bala I, Bhardwaj V, Hariharan S,. Analytical methods for assay of ellagic acid and its solubility studies [J]., 2006, 40(1): 206-210.

[6] 范高福, 劉修樹, 湯潔, 等. 石榴鞣花酸-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備 [J]. 中成藥, 2018, 40(6): 1388- 1392.

[7] Mady F M, Shaker M A. Enhanced anticancer activity and oral bioavailability of ellagic acid through encapsulation in biodegradable polymeric nanoparticles [J]., 2017, 12: 7405-7417.

[8] Gopalakrishnan L, Ramana L N, Sethuraman S,. Ellagic acid encapsulated chitosan nanoparticles as anti-hemorrhagic agent [J]., 2014, 111: 215-221.

[9] 鄭娟, 沈成英, 龐建云, 等. 丹參酮IIA納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外評(píng)價(jià)及其對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響 [J]. 中草藥, 2016, 47(24): 4340-4344.

[10] 管慶霞, 張偉兵, 張喜武, 等. 馬錢子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方與制備工藝的優(yōu)化 [J]. 中草藥, 2018, 49(11): 2557-2563.

[11] 李月靈, 王麗華, 周競. 青藤堿磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備、表征及藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2019, 31(4): 669-674.

[12] 龐建云, 沈成英, 周敏, 等. 異補(bǔ)骨脂素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外溶出及其抗白癜風(fēng)活性研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(8): 1796-1801.

[13] 顏潔, 關(guān)志宇, 朱衛(wèi)豐, 等. Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化自組裝法制備葛根素殼聚糖/海藻酸鈉口服納米粒的處方與工藝研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(23): 5706-5713.

[14] 荊玲, 范炎峰, 鄒夢(mèng)夢(mèng), 等. 延胡索乙素聚乳酸納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 中成藥, 2021, 43(3): 579-584.

[15] 姚艷勝, 季鵬, 劉暢, 等. 柚皮素固體脂質(zhì)納米粒凍干粉的制備及其大鼠肺部給藥藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(4): 591-598.

[16] 楊媛, 石磊, 楊軍軍, 等. 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定草莓中鞣花酸 [J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2016, 35(12): 1591-1595.

[17] 張笑顏, 薛璇璣, 王興斌, 等. 九牛造提取物與鞣花酸單體在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)比較研究 [J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2020, 37(10): 1182-1186.

[18] 毛艷婷, 馬姝麗, 白朝輝, 等. 木犀草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及其凍干粉的制備和體外釋藥研究 [J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2020, 40(23): 2423-2429.

[19] 胡瑞瑞, 張家梁, 郝海軍. 葫蘆素B磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備 [J]. 中成藥, 2019, 41(11): 2571-2576.

[20] 郜娜, 范明松, 楊慶宇, 等. 二氫楊梅素磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備、表征及藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(17): 4060-4067.

[21] 王震芳, 張智強(qiáng), 葛振華. 蛇床子素3種制劑的制備、表征及藥動(dòng)學(xué)比較研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(15): 3615-3621.

[22] 高彩芳, 夏加璇, 朱穎, 等. 納米技術(shù)在改善中藥有效成分成藥性中的應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2018, 49(12): 2754-2762.

[23] 徐凱, 魏永鴿. 高烏甲素磷脂復(fù)合物納米粒的制備、表征及藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2018, 30(5): 870-874.

[24] 任少琳, 符馨尹, 裔文靜. 肝素-泊洛沙姆407新材料應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2019, 38(1): 75-78.

[25] Singh A, Neupane Y R, Mangla B,. Nanostructured lipid carriers for oral bioavailability enhancement of exemestane: Formulation design,,, andstudies [J]., 2019, 108(10): 3382-3395.

[26] IparV S, Dsouza A, Devarajan P V. Enhancing curcumin oral bioavailability through nanoformulations [J]., 2019, 44(4): 459-480.

[27] Agarwal S, HariKumar S L, Negi P,. Quetiapine fumarate loaded nanostructured lipid carrier for enhancing oral bioavailability: Design, development and pharmacokinetic assessment [J]., 2021, 18(2): 184-198.

Formulation optimization of ellagic acid nanostructured lipid carriers and oral bioavailability study

WANG Xiao-xia1, ZHANG Zhi-qiang2

1. The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd., Tianjin 300301, China

To optimize the formulation of ellagic acid (EA) nanostructured lipid carriers (EA-NLC) using Box-Behnken design-response surface method, and conduct its pharmacokinetics studies.Emulsion ultrasonic method was used to prepare EA-NLC. Encapsulation rate, drug loading and particle size were taken as evaluation index, univariate investigation and Box-Behnken response surface design method were used to optimize the formulation of EA-NLC. The optimal formulation was characterized and pharmacokinetics behaviorwas also compared.The optimal formulation: lipid- drug ratio was 13.7∶1, solid-liquid lipid ratio was 4.4∶1 and surfactant concentration was 1.2%. Envelopment efficiency, drug loading and particle size of EA-NLC were (85.06 ± 0.48)%, (5.53 ± 0.15)%, and (166.5 ± 4.6) nm, respectively. The drug releasehas obvious sustained-release characteristics, and the release process conformed to the Weibull model: lnln[1/(1－M/∞)]＝0.682 1 ln－2.028 4,= 0.982 7. The main pharmacokinetic parameters such asmax,1/2,max, AUC0—tand AUC0—∞of EA-NLC had significant difference compared to ellagic acid (< 0.05, 0.01). The oral bioavailability of ellagic acid was enhanced to 4.67 times.The model established by the Box-Behnken design-response surface method could be used to optimize the formulation of EA-NLC with high accuracy and good prediction effect. And the oral bioavailability of ellagic acid was increased by EA-NLC effectively.

ellagic acid; nanostructured lipid carriers; pharmacokinetics; Box-Behnken design-response surface method; sustained- release characteristics; oral bioavailability

R283.6

A

0253 - 2670(2021)13 - 3862 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.010

2021-02-19

國家重大科技專項(xiàng)（2017ZX0911002-001-005）；河南省重大科技專項(xiàng)（182102731003）

王小霞（1976—），女，本科，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)。Tel: (0371)66912639 E-mail: wxx1888fafa@126.com

張智強(qiáng)（1984—），男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樾滤庨_發(fā)與設(shè)計(jì)。Tel: (022)29481572 E-mail: zhangzq1985@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]