海拔高度對(duì)蒙古黃芪主要藥效成分積累及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)量影響研究

吳 培，孫 卓, 2*，楊利民, 2*，韓 梅, 2

海拔高度對(duì)蒙古黃芪主要藥效成分積累及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)量影響研究

吳 培1，孫 卓1, 2*，楊利民1, 2*，韓 梅1, 2

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118 2. 省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118

研究不同海拔高度與蒙古黃芪var.主要藥效成分含量及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)量之間的關(guān)系。采用HPLC法檢測(cè)黃芪根中黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)黃芪甲苷生物合成過(guò)程中關(guān)鍵酶基因乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶[AACT,acetoacetyl-co zyme A (CoA) thiolase]、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMG-CoA synthase，HMGS）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶[3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase，HMGR]、異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（iso-pentenyl diphosphate isomerase，IDI）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）、鯊烯合酶（squalene synthase，SS）、鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）、環(huán)阿爾庭烷合酶（cycloartenol synthase，CAS）基因的表達(dá)量。4個(gè)樣地中樣地HQ-2（內(nèi)蒙呼和浩特可可以力更鎮(zhèn)）中黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及總皂苷含量普遍高于其他樣地；相關(guān)性分析表明，海拔高度對(duì)黃芪總皂苷合成的影響較大，、和基因在黃芪總皂苷的合成過(guò)程中起主要作用，海拔高度有利于、和基因的表達(dá)，海拔高度對(duì)黃芪皂苷合成途徑中關(guān)鍵酶基因具有一定的調(diào)控作用。在處于海拔1730 m左右的地區(qū)種植蒙古黃芪有利于其藥效成分的積累。

蒙古黃芪；基因表達(dá)；總皂苷；海拔高度

蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bge.) Hsiao.為豆科多年生草本植物，屬藥食兼用資源種，其主產(chǎn)區(qū)為我國(guó)山西、甘肅、內(nèi)蒙古等地[1]。隨著人民生活水平的改善和醫(yī)療保健水平的提高，黃芪的市場(chǎng)需求量持續(xù)增加，野生資源無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，因此自20世紀(jì)70年代中后期，黃芪藥材主要來(lái)源于人工栽培[2]。但目前蒙古黃芪的人工栽培普遍存在質(zhì)量不穩(wěn)，產(chǎn)量偏低等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了黃芪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

生態(tài)因素是影響藥材質(zhì)量形成的關(guān)鍵因素之一，包括氣候、土壤、海拔等生態(tài)因子[3]。其中，海拔高度對(duì)道地藥材的成分積累存在一定影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)，隨栽培地海拔的升高，同一生長(zhǎng)年限的黃芩中黃酮類成分含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，且有顯著性差異[5]。王寅秀等[6]研究發(fā)現(xiàn)，海拔100～800 m內(nèi)的人參多糖含量與海拔高度呈正相關(guān)，海拔950～1450 m人參多糖含量與海拔高度呈負(fù)相關(guān)；胡明勛等[7]研究發(fā)現(xiàn)海拔影響恒山野生蒙古黃芪藥材黃酮成分含量。目前，關(guān)于不同海拔高度與蒙古黃芪皂苷類、黃酮類成分含量及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)量之間的關(guān)系鮮有報(bào)道，因此，本研究從質(zhì)量和分子層面探究海拔與蒙古黃芪之間的關(guān)系，旨在確定蒙古黃芪的適宜栽培區(qū)域，為提高黃芪品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 自然概況與材料

1.1 自然概況

內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)平均海拔1050 m，屬西北大陸性氣候。四季分明，晝夜溫差較大，夏無(wú)酷暑，冬無(wú)嚴(yán)寒，全年平均氣溫在8 ℃左右。最冷月氣溫?12.7～?16.1 ℃；最熱月平均氣溫17～22.9 ℃。平均年較差為34.4～35.7 ℃，平均日較差為13.5～13.7 ℃。極端最高氣溫38.5 ℃，最低?41.5 ℃。日照時(shí)間年均1 600 h。土壤以沙壤土為主。

1.2 材料

1.2.1 樣品的采集與處理 于2018年10月21日在內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)4個(gè)樣地采集同一生育時(shí)期蒙古黃芪樣品116份。采用五點(diǎn)采樣法采集黃芪樣品，將樣品低溫條件下運(yùn)輸，帶回實(shí)驗(yàn)室后小心清洗，冷凍保存。將剩余樣品烘干至恒定質(zhì)量，粉碎并過(guò)100目篩，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有樣品由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利民教授鑒定為蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bge.) Hsiao.，樣地信息見(jiàn)表1。

表1 樣地信息

1.2.2 試劑 百泰克植物多糖多酚總RNA提取試劑盒，百泰克反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百泰克生物有限公司），SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒（DRR081A）（日本TaKaRa有限公司），黃芪甲苷對(duì)照品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)20633-67-4）購(gòu)于大北京索萊寶公司，乙腈，甲醇為色譜純，乙醇以及其他試劑均為分析純，蒸餾水。

1.2.3 儀器 AUY220電子天平；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱；DL-820E智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；Agilent1260高效液相色譜儀（Agilent，美國(guó)）；依利特ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；ProFlex?梯度PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，美國(guó)）；Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Agilent公司，美國(guó)）；NanoDrop 2000核酸/蛋白定量?jī)x（Thermo公司，美國(guó)）；DYY-8C型電泳儀（北京六一電泳廠）；Tanon Gis-2010凝膠成像系統(tǒng)［天能科技（上海）有限公司］；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；高速萬(wàn)能打粉機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

2 方法

2.1 蒙古黃芪黃芪甲苷含量的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精確稱量黃芪甲苷對(duì)照品2.46 mg置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精確稱量蒙古黃芪根部樣品1.00 g，加入15 mL甲醇超聲提取30 min，提取3次，合并濾液，用蒸發(fā)皿在水浴鍋中65 ℃下蒸發(fā)溶劑，加入甲醇溶解，隨后將提取物離心，定容至1 mL，選擇0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)上清液。

2.1.3 色譜條件[8]Agilent 1260型高效液相色譜儀UV檢測(cè)器；色譜柱：依利特Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；乙腈-水（32∶64）等度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)時(shí)間30 min。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10 μL 注入液相色譜儀，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以黃芪甲苷峰面積為橫坐標(biāo)（），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)（），繪制線性回歸方程，＝449.1－1.001 2，2＝0.994。記錄色譜圖（圖1），并計(jì)算黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品 (A) 和蒙古黃芪(B) 樣品的高效液相色譜圖

2.1.5 精密度試驗(yàn) 吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.72%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)儀器的精密度較好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取蒙古黃芪粉（HQ-1）1.0 g，按照“2.1.2”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.94%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份藥材樣品（HQ-1），按照“2.1.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，在室溫下分別于 0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算黃芪甲苷的RSD值為1.88%，說(shuō)明供試品溶液能在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批（HQ-1）黃芪樣品6份，每份樣品1.0 g，加入黃芪甲苷對(duì)照品甲醇溶液1 mL，室溫?fù)]干，按照“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，測(cè)定，加樣回收率為97.6%，RSD值小于3%。

2.2 蒙古黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精確稱量毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品2.37 mg，置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 以“2.1.2”項(xiàng)中提取的濾液為供試品。

2.2.3 色譜條件 色譜條件為安捷倫Agilent（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈和0.2%甲酸；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10 μL[10]。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10 μL 注入液相色譜儀，按照“2.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程＝25.712－3.297 2，2＝0.999 6，記錄色譜圖（圖2），計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

圖2 毛瑞異黃酮對(duì)照品(A) 和黃芪樣品(B) 的高效液相色譜圖

2.2.5 精密度試驗(yàn) 吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.72%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取蒙古黃芪粉（HQ-1）1.0 g，按照“2.1.2”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.94%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份藥材樣品（HQ-1），按照“2.1.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，在室溫下分別于 0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷的RSD值為1.88%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批（HQ-1）黃芪樣品6份，每份樣品1.0 g，加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品甲醇溶液1 mL，室溫?fù)]干，按照“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，測(cè)定，加樣回收率為99.6%，RSD值小于3%。

2.3 蒙古黃芪總皂苷含量的測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備 精確稱量不同產(chǎn)地蒙古黃芪樣品1.00 g，加入15 mL 80%乙醇超聲提取30 min，提取3次，合并濾液。用蒸發(fā)皿在水浴鍋中65 ℃下蒸發(fā)溶劑，加入80%甲醇溶解，隨后將提取物離心，揮干溶液，定容至5 mL，即得供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品5mg，置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液、供試品溶液適量，加入5%香草醛-冰醋酸試液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，充分振搖混勻后置于60 ℃恒溫水浴上加熱20 min，立即用冰水冷卻至室溫，再加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻。以試劑作空白，采用紫外分光光度法在200～700 nm進(jìn)行掃描，于570 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

2.3.4 線性方程的繪制以吸光度（）為縱坐標(biāo)、濃度（）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：= 4.368 7－0.041 4，2= 0.997，計(jì)算總皂苷含量。

2.4 蒙古黃芪根組織總RNA的提取

將保存在?80 ℃的蒙古黃芪根組織樣品在液氮中充分研磨至粉末狀，利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，研磨樣品約30 min，在研磨過(guò)程中，注意試驗(yàn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況以免樣品感染，最好選擇在冰上操作，以加大提取總RNA試驗(yàn)的成功率。利用NanoDrop 2000檢測(cè)儀測(cè)定蒙古黃芪根組織中RNA濃度，并對(duì)提取得到的總RNA進(jìn)行完整性檢測(cè)。選用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒，按試劑盒中提供的操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的黃芪乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶[acetoacetyl-co zyme A (CoA) thiolase ，AACT]、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMG-CoA synthase，HMGS）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶[3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase，HMGR]、異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（iso-pentenyl diphosphate isomerase，IDI）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）、鯊烯合酶（squalene synthase，SS）、鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）、環(huán)阿爾庭烷合酶（cycloartenol synthase，CAS），以18S RNA為內(nèi)參基因，上海生物工程技術(shù)有限公司，引物序列見(jiàn)表2。

表2 基因序列引物

2.6 關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的測(cè)定

以各樣地地蒙古黃芪根組織的cDNA為模板，18S RNA為內(nèi)參基因，根據(jù)表2中各基因的引物序列，分別對(duì)、、、、、、和基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次，采用2?ΔΔCt法分析結(jié)果。PCR反應(yīng)體系為：滅菌水7.4 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM 10 μL，正反引物各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，共20 μL的反應(yīng)體系。RT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

2.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS和GraphPad Prism6等軟件進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地蒙古黃芪黃芪甲苷含量

內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪黃芪甲苷含量見(jiàn)圖3，各樣地蒙古黃芪中黃芪甲苷含量差異較大，其中HQ-4樣地的蒙古黃芪黃芪甲苷含量最高為0.066%，HQ-3蒙古黃芪黃芪甲苷含量最低為0.024%，二者相差2.73倍?！吨袊?guó)藥典》2015年版規(guī)定黃芪甲苷的含量為不小于0.04%，樣地HQ-1、HQ-2及HQ-4黃芪中黃芪甲苷含量達(dá)到國(guó)家藥典水平，樣地HQ-3黃芪未達(dá)到藥典規(guī)定。呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪中黃芪甲苷含量的排序由高到低依次為土默特左旗＞可可以力更鎮(zhèn)＞武川縣＞賽罕區(qū)。

圖3 不同樣地黃芪甲苷含量

3.2 不同產(chǎn)地蒙古黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量結(jié)果見(jiàn)圖4，HQ-2的蒙古黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高為0.409%，在HQ-1樣地蒙古黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷最低為0.085%；《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定黃芪甲苷的含量為不小于0.02%，均達(dá)到了藥典要求，其中樣地HQ-2黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量約為藥典規(guī)定的20倍。呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的排序由高到低依次為可可以力更鎮(zhèn)＞土默特左旗＞賽罕區(qū)＞武川縣。

圖4 不同樣地毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

3.3 不同產(chǎn)地蒙古黃芪總皂苷含量

內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪中總皂苷含量結(jié)果見(jiàn)圖5，HQ-2的蒙古黃芪總皂苷含量最高為11.064%，在HQ-4樣地蒙古黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷最低為1.591%。由圖可知，樣地HQ-1與HQ-2黃芪中總皂苷含量顯著高于樣地HQ-3與HQ-4。呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪中總皂苷含量的排序由高到低依次為可可以力更鎮(zhèn)＞武川縣＞賽罕區(qū)＞土默特左旗。

圖5 不同樣地總皂苷含量

3.4 蒙古黃芪根組織總RNA提取結(jié)果

將提取得到的不同產(chǎn)地蒙古黃芪根組織中總RNA進(jìn)行質(zhì)量濃度和純度檢測(cè)260/280和260/230值，260/280和260/230值可表明RNA的純度，260/280應(yīng)在2.0～2.2，若小于2.0說(shuō)明存在蛋白或有機(jī)物污染，若大于2.2說(shuō)明RNA已水解為單核苷酸。260/230應(yīng)在2.0～2.4，若小于 2.0說(shuō)明存在乙醇、異硫氰酸胍等殘留，若大于2.4說(shuō)明需用乙醇、乙酸鹽沉淀RNA。結(jié)果見(jiàn)表3，蒙古黃芪根組織中總RNA的質(zhì)量濃度和純度均較高，可用于下一步試驗(yàn)。

表3 不同樣地蒙古黃芪根部總RNA的檢測(cè)結(jié)果

3.5 關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的測(cè)定

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以18S RNA作為內(nèi)參基因，檢測(cè)呼和浩特地區(qū)蒙古黃芪根組織中、、、、、、、基因的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。HQ-1樣品中基因表達(dá)量最高為1.54，HQ-2樣品基因表達(dá)量最低為0.461，兩者相差3.35倍?；蚋鳟a(chǎn)地表達(dá)量相差不大，HQ-3樣品中基因相對(duì)表達(dá)量最低。、和基因在呼和浩特地區(qū)黃芪根組織表達(dá)趨勢(shì)基本一致，均是HQ-2樣地顯著高于其他省份黃芪?；虮磉_(dá)量最高是HQ-2，是表達(dá)量最低的HQ-3的4.6 倍左右?；騂Q-1與HQ-2中相對(duì)表達(dá)量普遍高于HQ-3與HQ-4相對(duì)表達(dá)量。HQ-1樣地基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他樣地為2.63。

圖6 不同樣地黃芪根中關(guān)鍵酶基因熒光定量PCR表達(dá)分析

3.6 海拔高度與黃芪活性成分的相關(guān)性分析

海拔高度在1000～1732 m，黃芪總皂苷含量與海拔高度呈顯著正相關(guān)（＜0.05），隨海拔高度的升高而增加，但海拔過(guò)高，反而不利于黃芪總皂苷的合成，在2427 m海拔時(shí)，黃芪中總皂苷含量最低；海拔高度在1056 m黃芪甲苷含量最低，其他海拔高度所采集蒙古黃芪黃芪甲苷含量差異不明顯；海拔高度在1732 m毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高，其他海拔高度所采集蒙古黃芪黃芪甲苷含量差異不明顯。

3.7 黃芪活性成分與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

黃芪皂苷和關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析，見(jiàn)表5，、和基因與黃芪總皂苷含量呈顯著正相關(guān)（＜0.05），說(shuō)明、和基因在黃芪總皂苷的合成過(guò)程中起主要作用；基因表達(dá)量與黃芪甲苷和黃芪中皂苷含量呈負(fù)相關(guān)，但是沒(méi)有達(dá)到顯著作用，說(shuō)明基因?qū)S芪皂苷的合成具有一定的抑制作用，但是作用不明顯；關(guān)鍵酶之間存在一定的相關(guān)性，說(shuō)明關(guān)鍵酶之間相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)黃芪皂苷的合成。

3.8 海拔高度與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

海拔高度與和基因表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與基因呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與其他基因沒(méi)有明顯的相關(guān)性，說(shuō)明、和基因表達(dá)量隨著海拔的升高而增加，海拔有利于、和基因的表達(dá)。

4 討論

藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成、積累與外部環(huán)境關(guān)系密切，直接影響藥用植物的質(zhì)量形成[11-13]。而次生代謝產(chǎn)物則源自于植物體內(nèi)本身的生理生化代謝活動(dòng)，為了在生產(chǎn)中獲得穩(wěn)定的藥材質(zhì)量，需要對(duì)植物次生代謝活動(dòng)的途徑、規(guī)律及其影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究。

表5 黃芪皂苷與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

環(huán)境因子是影響藥用植物活性成分的主要因素，環(huán)境因子主要包括土壤、氣候、海拔等[14]；本實(shí)驗(yàn)主要研究了海拔因子對(duì)黃芪質(zhì)量的影響，胡明勛等[7]對(duì)山西恒山野生蒙古黃芪質(zhì)量的環(huán)境因素研究，發(fā)現(xiàn)海拔對(duì)蒙古黃芪皂苷含量影響不大，本研究發(fā)現(xiàn)海拔高度在1000～1732 m，黃芪總皂苷含量與海拔高度呈顯著正相關(guān)（＜0.05），隨海拔高度的升高而增加，但海拔過(guò)高，反而不利于黃芪總皂苷的合成，在2427 m海拔時(shí)，黃芪中總皂苷含量最低；海拔高度在1056 m黃芪甲苷含量最低，其他海拔高度所采集蒙古黃芪黃芪甲苷含量差異不明顯；海拔高度在1732 m毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高，其他海拔高度所采集蒙古黃芪黃芪甲苷含量差異不明顯；內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)4個(gè)樣地中樣地HQ-2（內(nèi)蒙呼和浩特可可以力更鎮(zhèn)）中黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及總皂苷含量普遍高于其他樣地，可推斷出樣地HQ-2的海拔高度是最適海拔高度為1730 m左右。

中藥材次生代謝產(chǎn)物的合成過(guò)程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量具有主要作用，且受環(huán)境因子影響較大[15-16]；本研究分別選取上游、、基因，中游、、、基因，下游基因黃芪甲苷與及海拔高度進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)黃芪總皂苷與及基因均表現(xiàn)顯著正相關(guān)，這與韋赫等[16]研究結(jié)果相似。海拔高度與、及基因均有顯著關(guān)系，其中海拔高度與基因呈極顯著正相關(guān)，海拔高度與基因呈顯著正相關(guān)。因此，在分子層面上，闡述海拔高度有助于黃芪總皂苷積累的原因，選擇高海拔高度的樣地栽培黃芪能夠促進(jìn)、及基因的表達(dá)，從而提高蒙古黃芪中總皂苷的含量。

尋找到海拔高度與黃芪皂苷生物合成相關(guān)基因之間的聯(lián)系，有望找到海拔高度影響黃芪皂苷類成分的根本原因，明確黃芪所處環(huán)境中，海拔高度對(duì)黃芪皂苷類成分合成過(guò)程中起到的重要作用。本研究針對(duì)不同海拔高度黃芪制定更加科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)現(xiàn)中藥材質(zhì)量的可控性提供理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on effect of altitude on accumulation of main active components and expression of key enzyme genes of

WU Pei1, SUN Zhuo1, 2, YANG Li-min1, 2, HAN Mei1, 2

1. College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China 2. State Key Laboratory of Ecological Restoration and Ecosystem Management, Changchun 130118, China

was used as the experimental material to study the relationship between different altitude and the content of main effective components and the expression of key enzyme genes of.The content of astragaloside and genistein glucoside inroot was detected by HPLC, and the expression of key enzyme genes (AACT, HMGR, CAS, FPS, HMGs, IDI, SE, SS) in astragaloside biosynthesis was detected by qRT-PCR.The contents of astragaloside a, isoflavone glucoside, and total saponin in HQ-2 of four plots in Huhhot were higher than those in other plots. The correlation analysis showed that the altitude had a great influence on the synthesis of astragalus total saponins, and the genes of,andplayed a major role in the synthesis of astragalus total saponins. Altitude was favorable for the expression of,andgenes, and it also had a certain regulatory effect on key enzyme genes in astragaloside synthesis pathway.Plantingat an altitude of 1730 meters is beneficial to the accumulation of its active components.

(Fisch.) Bunge var.(Bge.) Hsiao.; gene expression;total saponins; altitude

R282.12

A

0253 - 2670(2021)13 - 4031 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.026

2020-11-09

國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-21）

吳 培，碩士研究生，主要從事生態(tài)學(xué)研究。Tel: 17390928256 E-mail: 1561485694@qq.com

孫 卓，博士，主要從事藥用植物病害防治及土壤微生態(tài)。Tel: 17390901105 E-mail: 329575068@163.com

楊利民，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥資源生態(tài)與藥材質(zhì)量調(diào)控。Tel: 13384309292 E-mail: ylmh777@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]