金水緩纖方治療肺纖維化的組分配伍研究

李建生，董浩然, 3，鄭萬春, 3，劉學(xué)芳, 3，田燕歌, 3，李君子, 3，馮素香，任周新, 3，趙 鵬, 3

金水緩纖方治療肺纖維化的組分配伍研究

李建生1, 2，董浩然1, 2, 3，鄭萬春1, 2, 3，劉學(xué)芳1, 2, 3，田燕歌1, 2, 3，李君子1, 2, 3，馮素香1, 2，任周新1, 2, 3，趙 鵬1, 2, 3

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點實驗室，河南 鄭州 450046 3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046

采用正交設(shè)計結(jié)合疾病模型優(yōu)化金水緩纖方組分配比、評價組分配伍的療效，獲得金水緩纖組分方。10種中藥組分作為金水緩纖方候選活性組分，分為不同功效組包括補氣組（人參皂苷Re和人參皂苷Rb1）、補腎組（淫羊藿苷和魯斯可皂苷元）、活血組（芍藥苷和丹皮酚）、化痰組（3,29-二苯甲?；闃侨嗜肌⒋惼に睾拓惸杆丶祝?、補肺組（異甘草素），以及采用組合法設(shè)置補氣、補腎和活血組的不同濃度配比組，采用正交設(shè)計設(shè)置化痰組不同濃度組；基于肺泡上皮細胞評價其活性，肺纖維化大鼠模型評價其療效，依次優(yōu)化組內(nèi)、組間配伍配比?；谡辉O(shè)計與細胞模型活性評價獲得組內(nèi)配伍：補氣組（人參皂苷Re）、補腎組（淫羊藿苷）、化痰組（川陳皮素-貝母素甲2∶12.5）、活血組（芍藥苷）、補肺組（異甘草素）；組間配伍：補腎組（淫羊藿苷）-化痰組（川陳皮素-貝母素甲2∶12.5）-活血組（芍藥苷）-補氣組（人參皂苷Re）-補肺組（異甘草素）為100∶（2∶12.5）∶6.25∶80∶8。金水緩纖組分I可顯著改善大鼠肺纖維化癥狀，并進一步優(yōu)化了金水緩纖組分I的配伍配比，獲得了組分明確、療效明顯的金水緩纖組分II，即為淫羊藿苷-川陳皮素-貝母素甲-芍藥苷-異甘草素為100∶2∶6.25∶6.25∶8。組分配伍研究可有效揭示中藥復(fù)方療效物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得組分明確、療效明顯的金水緩纖組分方。

肺纖維化；金水緩纖方；組分配伍；中藥復(fù)方；肺泡上皮細胞間質(zhì)化

彌漫性間質(zhì)性肺疾?。╠iffuse interstitial lung disease，DILD）是以肺泡壁為主包括肺泡周圍組織及其相鄰支撐結(jié)構(gòu)病變的一組非腫瘤、非感染異質(zhì)性疾病組成的疾病譜，其中以特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary disease，IPF）最具代表性[1]。IPF是一種病因不明的慢性進展性間質(zhì)性肺疾病，以進行性呼吸困難和肺功能下降為特征，且預(yù)后不良，許多證據(jù)表明其與一些危險因素（如遺傳因素、吸煙、環(huán)境暴露、病毒感染等）相關(guān)[2]。該病進展迅速，中位生存期僅為2.9年，甚至比肺癌患者更短[3]。IPF發(fā)病率、致殘率、死亡率逐年升高，社會經(jīng)濟負擔(dān)重[4]。

本研究團隊對中醫(yī)治療IPF進行文獻挖掘、長期臨床研究[5]，提出“正虛絡(luò)痹積損”為其主要病機[6]，擬定了以補益肺腎、活血化痰通絡(luò)為主要治法的金水緩纖方。其中人參可大補元氣，淫羊藿、麥門冬、熟地黃助陰精化生腎氣，瓜蔞、浙貝母、白果、陳皮、甘草可斂肺氣、化痰、散結(jié)、滲濕、理氣等，丹皮可活血化瘀。臨床實踐表明，該方可明顯改善患者臨床癥狀、減緩病情進展、提高生存質(zhì)量等。動物實驗顯示，金水緩纖方對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠療效顯著，有效改善肺功能、肺組織病理損傷、膠原沉積，抑制氧化應(yīng)激等[7]；此外，該方還可抑制肺泡上皮間質(zhì)化、成纖維細胞活化等。但金水緩纖方療效物質(zhì)復(fù)雜、作用機制不清，影響了方藥的療效穩(wěn)定與臨床應(yīng)用及深度研發(fā)。

組分配伍是揭示方劑物質(zhì)基礎(chǔ)與配伍機制的有效途徑。組分方劑是以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，遵循中藥方劑的配伍理論與原則，基于臨床適應(yīng)病相關(guān)體內(nèi)外疾病模型，獲得方劑有效部位、一類成分或單體成分，進行配伍、配比2個層次的優(yōu)化設(shè)計，得到最佳組合的組分方劑，進而結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法，從整體、細胞、分子水平深入揭示其配伍機制，以期獲得組分明確可控、機制清晰的組分方劑[8-10]。

本研究將金水緩纖方所含中藥分為5個功效組：補氣組（人參）、補腎組（淫羊藿、麥門冬、熟地黃）、化痰組（瓜蔞、浙貝母、白果、陳皮）、補肺組（甘草）及活血組（丹皮）。文獻調(diào)研獲取各中藥有效組分，采用正交設(shè)計、全排列方法結(jié)合肺纖維化相關(guān)細胞模型活性評價優(yōu)化各功效組內(nèi)組分配比、功效組間配比，采用博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型評價其療效及優(yōu)化其配伍，獲得了與金水緩纖方療效相當(dāng)?shù)慕鹚徖w組分方。

1 材料

1.1 細胞

肺癌A549細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 動物

SPF級6～8周齡SD大鼠252只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購自河南省實驗動物中心（SCXK [豫] 2017–0001），動物許可證編號41003100005603。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理審查委員會審查批準(zhǔn)（DWLL16020025）。動物飼養(yǎng)室內(nèi)以12 h/12 h晝夜循環(huán)照明，溫度維持在26 ℃，濕度50%，動物自由攝食及飲水。

1.3 藥物

金水緩纖方組成為人參、熟地黃、麥冬、瓜蔞、浙貝母、牡丹皮、陳皮、炙甘草（鄭州瑞龍制藥股份有限公司，批次分別為17110101、19080201、17040101、19110102、16120101、19100101、19120103、19120101），炙淫羊藿（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號1711005），炒白果仁（廣東匯群中藥飲片股份有限公司，批號20181101）。中藥材經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馮素香教授鑒定植物來源為人參C. A. Mey.、地黃Libosch.、麥冬(L. f) Ker. -Gawl.、栝樓Maxim.、浙貝母Miq.、牡丹Andr.、橘Blanco、甘草Fisch、淫羊藿Maxim.、銀杏L.。金水緩纖方制備方法：取陳皮、浙貝母、炙淫羊藿、牡丹皮、白果適量，采用70%乙醇回流提??；取麥冬、炙甘草、熟地黃、瓜蔞適量，采用水煎煮濾過，濾液與上述醇提液合并；人參粉碎為最細粉，與上述合并液減壓干燥，粉碎成細粉，5%羧甲基纖維素鈉充分混懸后備用。

人參皂苷Re（批號CHB170926），成都克洛瑪生物科技有限公司；人參皂苷Rb1（批號MUST- 17060106）、淫羊藿苷（批號MUST-17051810）、魯斯可皂苷元（批號MUST-16061703）、芍藥苷（批號MUST-16041901）、丹皮酚（批號MUST- 16071405）、3,29-二苯甲?；闃侨嗜迹ㄅ朚UST-16121911）、川陳皮素（批號MUST- 16070901）、貝母素甲（批號MUST-16031101）、異甘草素（批號MUST-17012503），成都曼思特生物科技有限公司），以上成分質(zhì)量分數(shù)均≥98%。硫酸博來霉素（150 mg/瓶，批號s1214-12，Selleck公司），使用生理鹽水溶解為質(zhì)量濃度30 mg/mL的液體。吡非尼酮膠囊（艾思瑞，100 mg×54粒/瓶，批號150603，北京康蒂尼藥業(yè)有限公司）。

1.4 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（批號20170718）、青鏈霉素雙抗（批號20170519），北京索萊寶科技有限公司）；四季青胎牛血清（批號18100505），浙江天杭生物科技股份有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1（批號HY-P70433），MedChemExpress Co. Ltd.；羥脯氨酸檢測試劑盒（批號BC0255）由北京索萊寶科技有限公司提供；E-鈣黏素（E-cadherin，E-cad）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號UFKA99Y405）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號61G3R8SP7R）、纖連蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒（批號C4HP6WGQAG）、I型膠原（collagen 1，COL1）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號B2R6AQ4YV4）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β酶聯(lián)免疫試劑盒（批號7EAX33B53N）、白細胞介素（interleukin，IL）-13酶聯(lián)免疫試劑盒（批號5GXY39Z68R），武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號20180603）、Masson三色染色試劑盒（批號20180708），北京索萊寶科技有限公司；COL1抗體（批號GR3244041- 2）、III型膠原（collagen 3，COL3）抗體（批號GR3272398-8）、α-SMA抗體（批號GR282976-24），Abcam公司；0.25%胰酶（批號20170427）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF，批號20170912）、高效RIPA細胞蛋白提取裂解液（批號20170815），北京索萊寶生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.5 儀器

WBP無束縛小動物全身體積描記系統(tǒng)、FinePointe? Series PFT System（BUXCO?公司，美國），低溫高速離心機（Eppendorf公司，德國），ELX800UV型酶標(biāo)儀（Bio Tek公司，美國），RM2145型自動切片機（Leica公司，德國），TissueLyser II樣品破碎系統(tǒng)（Qiange公司，德國），CK40倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），生化培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備責(zé)任有限公司），Milli Q Synthesls超凈純水機（Millipore公司，美國），IVC-II型動物飼養(yǎng)籠具（馮氏實驗動物設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 細胞模型建立及指標(biāo)檢測

A549細胞采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。A549細胞以3×105個/孔接種于6孔板中，24 h后分為對照組、模型組（7.5 ng/mL TGF-β1）、給藥組（7.5 ng/mL TGF-β1＋候選組分），每組3復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集上清培養(yǎng)液，用ELISA法檢測上清中α-SMA、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）含量。每孔加300 μL RIPA細胞裂解液收集細胞蛋白，用于檢測E-cad水平。

2.2 金水緩纖方各功效組內(nèi)組分配比優(yōu)化

基于文獻報道與前期研究，選取10種中藥組分作為金水緩纖方候選活性組分，并依據(jù)其來源中藥功效分為不同功效組：補腎組（淫羊藿苷和魯斯可皂苷元），化痰組（3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、川陳皮素和貝母素甲），活血組（芍藥苷和丹皮酚），補氣組（人參皂苷Re和人參皂苷Rb1），補肺組（異甘草素）。其中補氣、補腎和活血組含2種成分，采用組合法結(jié)合細胞模型活性評價優(yōu)化其配比；化痰組含3種成分，采用正交設(shè)計結(jié)合細胞模型活性評價優(yōu)化其配比；而補肺組含1種成分則不再優(yōu)化。采用二甲基亞砜分別配制10種候選組分儲備液，質(zhì)量濃度分別為人參皂苷Re 100 mg/mL、人參皂苷Rb1100 mg/mL、淫羊藿苷100 mg/mL、魯斯可皂苷元50 mg/mL、芍藥苷100 mg/mL、丹皮酚100 mg/mL、3,29-二苯甲?；闃侨嗜?00 mg/mL、川陳皮素64 mg/mL、貝母素甲100 mg/mL、異甘草素20 mg/mL，保存于?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 金水緩纖方各功效組間配比優(yōu)化

在各功效組內(nèi)配比確定的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化組間配比，采用正交設(shè)計結(jié)合細胞模型活性評價，綜合評分優(yōu)化功效組間配比。

(α-SMA/FN)＝(/X) / max (/1：/25)×100

(E-cad)＝(X/) / max (1/：25/)×100

綜合評分＝[(α-SMA)＋(FN)＋(E-cad)]/3

為模型組值，X為藥物干預(yù)值，max (1/：25/)為1/至25/的最大值

2.4 肺纖維化大鼠模型建立、分組與給藥

采用一次性氣管內(nèi)滴注博萊霉素法建立肺纖維化大鼠模型。大鼠麻醉后，對照組氣管插管注射給予生理鹽水，其余各組氣管滴注給予博來霉素（5 mg/kg），隨即輕旋大鼠，置于恒溫環(huán)境保持大鼠體溫恒定，待完全蘇醒后回籠。將造模日定為第0天，自第29天起ig給予相應(yīng)藥物。金水緩纖組分方I療效評價：對照組及模型組ig給予生理鹽水（2 mL/只）；吡非尼酮組ig給予吡非尼酮溶液（108 mg/kg）；金水緩纖組分方I組給藥劑量為24.14、12.07、8.04、6.03、4.83 mg/kg。每組6只大鼠。

金水緩纖組分方I優(yōu)化實驗分組及給藥：對照組及模型組ig給予生理鹽水（2 mL/只）；吡非尼酮組ig給予吡非尼酮溶液（108 mg/kg）；金水緩纖方組ig給予金水緩纖方（3.18 g/kg）；金水緩纖組分方I及其各優(yōu)化組藥物配比見表1，按各組分方配比稱取各組分，按照6 mL/kg給藥體積采用5%羧甲基纖維素鈉充分混懸各組分方。每組6只大鼠。

表1 金水緩纖組分方I及其優(yōu)化組的組分與給藥劑量

2.5 肺指數(shù)及肺組織羥脯氨酸檢測

給藥至第42天，各組大鼠ip 1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg），腹主動脈放血處死大鼠。取大鼠全肺，于生理鹽水中洗凈，吸水紙吸凈后稱其濕質(zhì)量，計算肺指數(shù)（肺質(zhì)量/體質(zhì)量）。

取肺組織50 mg，加500 μL提取溶液勻漿，煮沸3 h，離心（25 ℃、12 000×、10 min），使用濾頭濾過雜質(zhì)，蒸餾水定容至4 mL，取上清，檢測560 nm處吸光度，計算肺組織羥脯氨酸的含量。操作嚴格按照羥脯氨酸檢測試劑盒說明書進行。

2.6 HE染色和Masson染色觀察肺組織病理變化

肺組織石蠟切片行常規(guī)HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。依據(jù)Szapiel法針對肺泡炎及肺纖維化進行病理評分。HE染色評分：0級，無肺泡炎；I級，輕度肺泡炎，肺泡間隔因細胞浸潤增寬，病變范圍占全肺的20%以下；II級，中度肺泡炎，病變范圍超過全肺的20%～50%；III級，彌漫性肺泡炎，病變范圍超過全肺50%。MASSON染色評分：0級，無肺間質(zhì)纖維化；I級，輕度肺間質(zhì)纖維化，受累范圍少于全肺的20%；II級，中度肺間質(zhì)纖維化，受累范圍占全肺的20%～50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；III級，重度肺間質(zhì)纖維化，受累范圍超過全肺的50%，肺泡融合，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。

2.7 酶聯(lián)免疫法檢測TGF-β、IL-13和COL1水平

大鼠腹主動脈采血，離心取上清，?80 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒檢測按操作說明書檢測血清中TGF-β、COL1、IL-13水平。

2.8 免疫組化法檢測COL1、COL3和α-SMA水平

肺組織石蠟切片行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色，檢測COL1、COL3和α-SMA，采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像采集及分析系統(tǒng)（Media Cybernetics. Inc）計算圖像積分光密度（integral optical density，IOD）值。

2.9 R值綜合評價

采用R值綜合評價法對羥脯氨酸含量，肺組織病理（HE染色、MASSON染色），肺組織免疫組化COL1、COL3和α-SMA等指標(biāo)進行R值計算。篩選與金水緩纖組分方I等效的金水緩纖組分方II。

dM＝(2－1)/

＝(1＋2)/2

dMen＝(x－2)/Z

Z＝(s＋2)/2

R=dMen/dM

dM表示疾病影響，1為對照組平均值，2為模型組平均值，1為對照組標(biāo)準(zhǔn)差，2為模型組標(biāo)準(zhǔn)差；dMen表示藥物作用，x為第個藥物組平均值，s為第個藥物組標(biāo)準(zhǔn)差；R為第個藥物組R值

2.10 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 金水緩纖方的功效組內(nèi)配伍優(yōu)化

采用組合法設(shè)置補氣組分（人參皂苷Re、Rb1）、補腎組分（淫羊藿苷和魯斯可皂苷元）、活血組分（芍藥苷和丹皮酚）的配比?；钚栽u價結(jié)果顯示，補氣組、補腎組、活血組及其各自配伍可不同程度抑制上皮細胞間質(zhì)化。采用R值綜合評價法評價各藥物療效強度，結(jié)果顯示，補腎組淫羊藿苷、活血組芍藥苷作用最優(yōu)。補氣組以人參皂苷Re 80 μg/mL、Rb15 μg/mL組合作用最優(yōu)，人參皂苷Re 20 μg/mL作用次之，但兩者之間無差異，單體成分易于后續(xù)研究且成本較低，因此選擇人參皂苷Re作為補氣組代表組分（表2～4）。

表2 補氣組分人參皂苷Re、Rb1不同配比對肺泡上皮細胞間質(zhì)化影響()

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below

表3 補腎組分淫羊藿苷、魯斯可皂苷元不同配比對肺泡上皮細胞間質(zhì)化影響()

采用6因素5水平正交設(shè)計表L25(56) 設(shè)置化痰組栝樓三醇、川陳皮素、貝母素甲的分組。結(jié)果顯示，栝樓三醇、川陳皮素、貝母素甲及其配伍可有效抑制上皮細胞間質(zhì)化（表5）；正交設(shè)計分析顯示，化痰組最優(yōu)組合方案為A0B2C12.5，即栝樓三醇0 μg/mL、川陳皮素2 μg/mL、貝母素甲12.5 μg/mL（表6）。

3.2 功效組間配伍優(yōu)化

根據(jù)以上結(jié)果，將補腎組（淫羊藿苷）、化痰組[川陳皮素-貝母素甲（2∶12.5）]、活血組（芍藥苷）、益氣組（人參皂苷Re）、補肺組（異甘草素）共5組進行正交設(shè)計，采用6因素5水平正交設(shè)計表L25(56)，基于上皮細胞間質(zhì)化模型優(yōu)化各組間配比（表7），從中優(yōu)化獲得金水緩纖組分方I。結(jié)果顯示，各組配伍可不同程度抑制上皮細胞間質(zhì)化（表8），各組最優(yōu)組合方案為A5B2C1D5E4，即金水緩纖組分方I的各功效組最佳配比：補腎組（淫羊藿苷）-化痰組 [川陳皮素-貝母素甲（2∶12.5）]-活血組（芍藥苷）-補氣組（人參皂苷Re）-補肺組（異甘草素）為100∶（2∶12.5）∶6.25∶80∶8（表8）。

3.3 金水緩纖組分方I對肺纖維化大鼠的療效評價

3.3.1 金水緩纖組分方I對肺纖維化大鼠肺組織病理和肺功能的影響 大鼠肺組織HE染色顯示，模型組大鼠可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，炎性細胞浸潤；與模型組比較，金水緩纖組分方I可顯著改善其病理變化，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥減輕；吡非尼酮也可改善其病理變化。Masson染色顯示，與對照組比較，模型組肺泡隔膠原沉積明顯；與模型組比較，金水緩纖組分方I肺膠原沉積明顯減少；吡非尼酮也可降低膠原沉積，改善病理變化。與對照組比較，模型組大鼠的肺指數(shù)明顯升高（＜0.01），而金水緩纖組分方I各劑量與吡非尼酮可明顯降低肺指數(shù)（＜0.05）（圖1-A）。

組別芍藥苷/(μg·mL?1)丹皮酚/(μg·mL?1)E-cad/(ng·mL?1)α-SMA/(pg·mL?1)FN/(ng·mL?1)R綜合 對照001.79±0.040.19±0.021.16±0.54 模型000.19±0.01##2.48±0.26##3.72±0.27##2.50±0.00 1 12.5 3.130.34±0.03**3.45±0.326.15±0.39**2.92±0.67 2 12.5 6.250.17±0.023.10±0.06*5.54±0.34**2.90±0.48 3 12.512.500.15±0.01*2.97±0.12*6.05±0.41**2.93±0.56 4 12.525.000.09±0.01**2.51±0.043.56±0.092.51±0.15 5 25.0 3.130.11±0.004**3.22±0.21*5.31±0.11**3.07±0.66 6 25.0 6.250.12±0.01**3.74±0.17**6.34±0.37**3.09±0.63 7 25.012.50.09±0.001**3.04±0.304.50±0.28*2.79±0.16 8 25.025.000.09±0.002**2.95±0.13*5.49±0.62**2.85±0.25 9 50.0 3.130.24±0.043.70±0.08**5.53±0.12**3.13±0.77 10 50.0 6.250.27±0.02*3.58±0.29**4.31±0.14*2.71±0.27 11 50.012.500.23±0.063.18±0.10*3.96±0.772.60±0.13 12 50.025.000.10±0.01**2.75±0.073.92±0.392.61±0.02 13100.0 3.130.09±0.01**2.76±0.234.81±0.36*2.76±0.25 14100.0 6.250.10±0.02**2.51±0.033.90±0.772.55±0.04 15100.012.500.11±0.02*2.54±0.053.69±0.122.53±0.05 16100.025.000.11±0.01**2.40±0.153.73±0.482.54±0.08 17 13.000.30±0.03*1.86±0.12*2.70±0.12**2.13±0.40 18 25.000.31±0.03*1.73±0.442.88±0.33*2.28±0.19 19 50.000.23±0.022.12±0.102.67±0.31*2.25±0.29 20100.000.24±0.022.63±0.172.44±0.20*2.21±0.50 210 3.130.20±0.052.95±0.09*2.63±0.29*2.35±0.41 220 6.250.10±0.01**3.28±0.843.00±0.432.47±0.26 23012.500.11±0.022.54±0.093.45±0.192.47±0.14 24025.000.11±0.012.47±0.092.81±0.282.38±0.36 25050.000.04±0.00**4.92±2.222.13±0.112.23±0.92

3.3.2 金水緩纖組分方I對肺纖維化大鼠肺組織膠原、纖維化因子及血清炎癥因子水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織羥脯氨酸與COL1水平顯著升高（＜0.01），而高劑量金水緩纖組分方I與吡非尼酮可明顯降低羥脯氨酸含量（＜0.01），見圖1-B。各劑量金水緩纖組分方I均可降低COL1水平（＜0.05），見圖1-C。此外，與對照組比較，模型組大鼠血清中TGF-β和IL-13水平顯著升高（＜0.01），各劑量金水緩纖組分方I均可明顯降低TGF-β和IL-13水平（＜0.05、0.01），見圖1-D、E。

3.4 基于肺纖維化大鼠療效的金水緩纖組分方I的配伍優(yōu)化

3.4.1 金水緩纖組分方I優(yōu)化組對肺纖維化大鼠肺組織病理與肺功能的影響 HE和Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，炎性細胞浸潤，肺泡隔膠原沉積明顯；與模型組比較，金水緩纖組分方I及其各優(yōu)化組可不同程度改善其病理變化，保護肺泡結(jié)構(gòu)，減輕炎癥，降低膠原沉積。病理評分結(jié)果顯示，金水緩纖組分方I優(yōu)化組1和4可顯著降低HE染色病理評分（圖2-A）；優(yōu)化組4、7、8可顯著降低Masson染色病理評分（圖2-B）。與對照組比較，模型組大鼠的肺指數(shù)明顯升高（＜0.05），而金水緩纖組分方I及其優(yōu)化組1、4、8可明顯降低肺指數(shù)（＜0.05），見圖3-A。

表5 化痰組不同配比對肺泡上皮細胞間質(zhì)化的影響()

表6 化痰組正交試驗結(jié)果

續(xù)表6

實驗號栝樓三醇/ (μg·mL?1)（A）川陳皮素/ (μg·mL?1)（B）貝母素甲/ (μg·mL?1)（C）空白（D）空白（E）空白（F）綜合評分 1112.500 25.052464.51 1212.502 50.013565.63 1312.504100.024166.18 1412.506 035256.89 1512.508 12.541360.56 1625.000 50.025364.59 1725.002100.031464.70 1825.004 042566.65 1925.006 12.553157.64 2025.008 25.014356.74 2150.000100.043257.61 2250.002 054347.94 2350.004 12.515456.26 2450.006 25.021557.70 2550.00850.032171.25 K174.0760.60 58.5360.4958.5762.47 K265.7468.18 67.2270.9874.3153.96 K362.7766.25 65.7168.3066.8577.18 K462.0662.50 65.5563.7060.7164.59 K558.1565.26 65.7959.3362.3664.59 R15.917.588.6911.6515.7423.22

表7 各組間配比L25(56) 正交設(shè)計

表8 各組間配比正交設(shè)計結(jié)果()

續(xù)表8

組別補腎（A）化痰（B）活血（C）補氣（D）甘草（E）空白（F）E-cad/(ng·mL?1)α-SMA/(pg·mL?1)FN/(ng·mL?1)綜合評分 51555551.67±0.05**9.16±0.47**92.68±4.67**70.53 62123451.44±0.12**10.02±0.93**94.46±5.02**64.77 72234511.88±0.02**8.30±1.05**126.94±2.43**69.79 82345121.62±0.03**8.95±0.65**90.84±15.45**70.97 92451231.71±0.15**9.25±0.50**185.23±5.95**59.51 102512341.95±0.13**8.78±0.74**120.46±5.51**70.06 113135242.26±0.32**9.54±0.53**150.71±113.2668.47 123241351.87±0.10**8.63±0.62**104.90±3.65**72.06 133352411.93±0.06**7.49±0.34**99.27±4.31**78.23 143413521.23±0.129.24±0.74**86.68±6.02**66.06 153524131.44±0.1911.63±0.66**106.19±36.11**59.06 164142531.06±0.159.36±0.39**111.28±3.45**58.18 174253141.82±0.15**7.99±0.99**108.60±5.21**72.97 184314251.78±0.02**8.50±0.70**97.35±3.86**72.89 194425311.68±0.04**7.68±0.20**102.42±6.03**73.51 204531431.68±0.377.54±0.25**100.50±3.95**74.53 215154321.68±0.27*8.58±3.05**97.90±12.48**71.24 225215431.67±0.11**7.18±0.51**62.93±1.89**88.44 235321541.57±0.228.93±0.39**78.77±12.4473.92 245432151.35±0.06*10.36±0.60**105.40±2.85**60.58 255543211.80±0.008.16±1.6791.97±14.28*75.52 K165.85663.88870.84667.36064.07270.766 K267.02074.83068.43067.58869.45655.832 K368.77671.06866.54067.73069.24079.810 K470.41666.28269.69668.94675.54471.434 K573.94069.94070.49674.38467.69668.166 R 8.08410.942 4.306 7.02411.47223.978

3.4.2 金水緩纖組分方I優(yōu)化組對肺纖維化大鼠肺組織膠原和纖維化因子水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中羥脯氨酸、COL1、COL3、α-SMA水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，金水緩纖方、金水緩纖組分方I和各優(yōu)化組可不同程度地降低羥脯氨酸、COL1、COL3、α-SMA水平：優(yōu)化組分方4、5顯著降低羥脯氨酸和COL1水平（＜0.05、0.01）；金水緩纖方、金水緩纖組分方I和優(yōu)化組分方4、5、7顯著降低COL3水平（＜0.05、0.01）；金水緩纖方、金水緩纖組分方I和優(yōu)化組分方1、3、4、7、8顯著降低α-SMA水平（＜0.05、0.01），見圖3-B和圖4。

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，圖2～5同

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below fig. 2—5

G1～G8分別表示金水緩纖組分方I的優(yōu)化組分方1～8，下圖同 A-HE B-Masson

3.4.3 金水緩纖組分方I及其各優(yōu)化組對肺纖維化大鼠療效綜合評價 采用R值綜合評價法評價各優(yōu)化組對HE、Maason、膠原表達等療效指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，金水緩纖方、金水緩纖組分方I及其各優(yōu)化組分方均可顯著降低R值（圖6）。其中優(yōu)化組分方4的R值最低，故選擇優(yōu)化組分方4作為金水緩纖組分II。

4 討論

“正虛絡(luò)痹積損”為肺纖維化主要病機，基于此擬定的金水緩纖方具有補益肺腎、活血化痰的作用；可明顯改善患者臨床癥狀、減緩病情進展、提高生存質(zhì)量[6]。本研究以金水緩纖方為示范，建立了組分配伍方劑研究技術(shù)方法：基于文獻調(diào)研篩選金水緩纖方候選有效組分，將有效組分按來源中藥的功效進行分組，采用組合、正交設(shè)計方法結(jié)合關(guān)鍵病理變化細胞模型的療效評價，依次優(yōu)化各功效組內(nèi)、組間配比；基于肺纖維化大鼠模型進行療效評價，獲得療效明顯的金水緩纖組分I，并進行組分配伍優(yōu)化，獲得與金水緩纖方、金水緩纖組分I療效相當(dāng)?shù)慕鹚徖w組分方II。

圖3 金水緩纖組分方I及其優(yōu)化組分方對肺纖維化大鼠肺指數(shù)(A)和羥脯氨酸含量(B) 的影響()

圖4 金水緩纖組分方I及其優(yōu)化組分方對肺纖維化大鼠肺組織膠原 (A、B) 與α-SMA (C) 水平的影響 ()

現(xiàn)代中藥研究表明，中藥成分化學(xué)成分眾多，其中包括生物活性成分和無效成分。而中藥復(fù)方的療效物質(zhì)即是由生物活性成分群構(gòu)成，針對特定疾病的療效可由特定生物活性成分介導(dǎo)的多靶點、多途徑整合發(fā)揮。因此，篩選針對特定疾病的活性成分是組分配伍研究的關(guān)鍵。本研究調(diào)研已有文獻查找金水緩纖方的各中藥中可調(diào)控肺纖維化相關(guān)病理環(huán)節(jié)的活性成分，并以此成分群作為金水緩纖方治療肺纖維化潛在活性成分。

圖5 金水緩纖組分方I及其優(yōu)化組分方對肺纖維化大鼠療效綜合評價()

中藥組分活性評價方法是明確活性組分和優(yōu)化組分配伍配比的重要手段。目前主要在分子、細胞和整體水平開展中藥組分活性評價。從實驗效率和性價比角度考慮，細胞水平的活性評價更適宜于中藥活性成分的篩選[11]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細胞逐漸向間充質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)化，喪失上皮細胞功能特性而獲得間質(zhì)細胞特性的過程。肺纖維化患者的II型肺泡上皮細胞增殖和分化為I型肺泡上皮細胞的能力降低，并向間質(zhì)細胞分化分泌多種促纖維化因子[12-13]。本研究基于前期建立的肺泡上皮細胞間質(zhì)化模型，評價了金水緩纖方的潛在活性組分，包括淫羊藿苷、魯斯可皂苷元、3,29-二苯甲?；闃侨嗜?、川陳皮素、貝母素甲、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、芍藥苷和丹皮酚、異甘草素。

中藥方劑是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，通過辨證施治結(jié)合病因病機，充分考慮藥物的性味歸經(jīng)及功效，依據(jù)“君、臣、佐、使”的根本原則最終確立的，具有極高的科學(xué)性。同樣，組分配伍方劑是基于臨床有效中藥方劑形成的，也必須以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，遵循中藥方劑的配伍理論與原則[11,14]。如研究者揭示了清開靈中主要組分治療腦缺血的重要機制，形成了由黃芩苷、梔子苷、膽酸、珍珠母配伍而成的清開靈組分方[15-16]；Wang等[10]將復(fù)方黃黛片中雄黃的有效成分四硫四化砷、青黛有效組分靛玉紅和丹參有效成分丹參酮IIA3者組合成為組分方，成功揭示了各組分及其配伍抗白血病作用與機制。針對特發(fā)性肺纖維化的臨床常見證候擬定的金水緩纖方具有補益肺腎、活血化痰通絡(luò)的功效。依據(jù)金水緩纖方組方可將其中藥劃分為補氣組（人參）、補腎組（淫羊藿、麥門冬、熟地黃）、補肺組（甘草）、化痰組（瓜蔞、浙貝母、白果、陳皮）、活血組（丹皮）。因此，本研究依據(jù)活血成分歸屬中藥，將活性成分分為補氣組（人參皂苷Re和人參皂苷Rb1）、補腎組（淫羊藿苷和魯斯可皂苷元）、補肺組（異甘草素）、化痰組（3,29-二苯甲?；闃侨嗜?、川陳皮素和貝母素甲）、活血組（芍藥苷和丹皮酚）作為功效組代表組分。正交試驗設(shè)計是為尋求最優(yōu)化水平組合的一種高效的多因素實驗，可通過部分試驗反映全面實驗，便于數(shù)據(jù)結(jié)果的分析，已被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的組分配伍優(yōu)化[17]。李雪梅等[18]利用均勻設(shè)計等多因素實驗優(yōu)化了扶正化瘀膠囊有效組分蟲草多糖、丹參酚酸B鹽、苦杏仁苷和絞股藍總皂苷，獲得了以蟲草多糖、苦杏仁苷和絞股藍總皂苷為有效組分的最優(yōu)配伍。本研究采用正交試驗設(shè)計對功效組內(nèi)、組間成分進行配伍配比優(yōu)化，獲得了成分明確、配比確定的金水緩纖組分方I。

基于現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的方法技術(shù)建立的臨床疾病相關(guān)動物模型，是臨床前藥理藥效評價與作用機制研究的重要載體[19]。周才秀等[16]基于線栓法建立大鼠腦缺血/再灌注模型，明確了清開靈組分配伍具有腦保護作用，進一步優(yōu)化了清開靈注射液原方藥物組成。本研究采用博來霉素氣管滴注誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型，并在滴注28 d后，待大鼠肺纖維化發(fā)生后ig給予金水緩纖組分方I，結(jié)果表明其可顯著改善大鼠肺纖維化。金水緩纖組分方I由人參皂苷Re、淫羊藿苷、異甘草素、川陳皮素、貝母素甲、芍藥苷組成，其組分仍然較多，且人參皂苷Re等市場價格較高，不利于組分方的臨床開發(fā)應(yīng)用。本研究基于肺纖維化大鼠模型，對金水緩纖組分方I進行配伍優(yōu)化，獲得由淫羊藿苷、異甘草素、川陳皮素、貝母素甲、芍藥苷組成的金水緩纖組分方II，其療效與金水緩纖方相當(dāng)。

本研究以治療肺纖維化有效方劑金水緩纖方為示范，開展了組分配伍研究，獲得了療效明顯、成分清楚的金水緩纖組分方；同時形成了適宜于呼吸病有效方劑組分配伍研究的系列技術(shù)方法，構(gòu)建了組分配伍研究平臺，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effective component compatibility-based analysis of Jinshui Huanxian formula for treatment of pulmonary fibrosis

LI Jian-sheng1, 2, DONG Hao-ran1, 2, 3, ZHENG Wan-chun1, 2, 3, LIU Xue-fang1, 2, 3, TIAN Yan-ge1, 2, 3, LI Jun-zi1, 2, 3, FENG Su-xiang1, 2, REN Zhou-xin1, 2, 3, ZHAO Peng1, 2, 3

1. Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Diseases Co-constructed by Henan Province & Education Ministry of China, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Key Laboratory of Chinese Medicine for Respiratory Disease, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 3. Academy of Chinese Medical Sciences, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To optimize the distribution ratio of Jinshui Huanxian formula (金水緩纖方, JHF) and evaluate the efficacy of component compatibility (ECC) by orthogonal design combined with disease model, in order to obtain the ECC.Ten active components of JHF were identified and divided into tonifying(ginsenoside Re, ginsenoside Rb1), tonifying kidney (icariin, ruscogenin), activating blood (paeoniflorin, paeonol), resolving phlegm (3,29-dibenzoyl rarounitriol, nobiletin and verticine), and tonifying lung (isoliquiritigenin) groups. The different concentration ratio groups of tonifying, tonifying kidney and activating blood groups were set by the combination method, and the different concentration groups of the phlegm-reducing group were set by the orthogonal design. Its activities were evaluated based on alveolar epithelial cells, and its efficacy was evaluated based on pulmonary fibrosis (PF) rat model. Intra-group and inter-group compatibility ratio were optimized respectively.The compatibility in group was obtained based on orthogonal design combined with cell model: tonifying(ginsenoside Re), tonifying kidney (icariin), resolving phlegm (nobiletin: verticine = 2 : 12.5), activating blood (paeoniflorin), tonifying lung (isoliquiritigenin); The compatibility among groups: tonifying kidney (icariin): resolving phlegm (nobiletin: verticine = 2 : 12.5): activating blood (paeoniflorin): tonifying(ginsenoside Re): tonifying lung (isoliquiritigenin) = 100:(2:12.5):6.25:80:8. Then, ECC of JHF I could significantly improve the symptom of PF rats. The active ingredients of effective-component compatibility of ECC-JHF I were optimized based on their therapeutic effect on rat and ECC-JHF II (icariin: nobiletin: verticine: paeoniflorin: isoliquiritigenin = 100:2:6.25:6.25:8) was obtained.The study of component compatibility can effectively reveal the material basis of the efficacy of traditional Chinese medicine compound, and the component prescription of JHF with clear components and obvious effect was obtained.

pulmonary fibrosis; Jinshui Huanxian formula; effective component compatibility; traditional Chinese medicine compound; alveolar epithelial-mesenchymal transition

R285

A

0253 - 2670(2021)13 - 3966 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.020

2020-11-12

國家自然科學(xué)基金面上項目（81673942）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81973822）

李建生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中醫(yī)藥防治呼吸疾病。Tel: (0371)65676568 E-mail: li_js8@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]