基于計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)以埃博拉病毒跨膜糖蛋白為靶點(diǎn)挖掘中藥抗病毒活性分子

史海龍，史永恒，王 川，程 怡，黃 月，劉繼平，王 斌

基于計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)以埃博拉病毒跨膜糖蛋白為靶點(diǎn)挖掘中藥抗病毒活性分子

史海龍，史永恒，王 川，程 怡，黃 月，劉繼平，王 斌*

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

基于埃博拉病毒跨膜糖蛋白（transmembrane glycoprotein of the Ebola virus，EBOV-GP）的三維空間結(jié)構(gòu)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)從中國臺灣中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫TCM@TAIWAN中尋找具有抗病毒作用的中藥活性分子。以EBOV-GP為靶點(diǎn)，采用類藥性評估、分子對接、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及吸收、分布、代謝和排泄（absorption、distribution、metabolism and excretion，ADME）預(yù)測等多尺度虛擬篩選策略，從TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫中挖掘候選藥效分子，并分析候選分子與靶點(diǎn)的相互作用情況。以胺碘酮為陽性對照藥物，篩選出4個(gè)類藥性良好的中藥單體ZINC85531496、ZINC85567560、ZINC85592968、ZINC33833122，與EBOV-GP親和力及相互作用基團(tuán)均優(yōu)于胺碘酮。采用多種計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)挖掘EBOV-GP抑制劑，可促進(jìn)從天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中提取、設(shè)計(jì)以及實(shí)驗(yàn)合成抗埃博拉病毒的藥效分子。

埃博拉病毒；跨膜糖蛋白；虛擬篩選；中藥；抗病毒活性分子

埃博拉病毒是一種致病性致病菌，可以引起人類和動(dòng)物出血熱，并在感染后7～11 d導(dǎo)致90%病例死亡。目前很多藥物和疫苗尚處于研發(fā)或臨床試驗(yàn)階段，因此迫切需要研發(fā)安全性高、耐藥性好的抗病毒藥物[1]。

埃博拉病毒帶有1個(gè)負(fù)義RNA基因組，包含7個(gè)編碼不同結(jié)構(gòu)蛋白的基??因，分別為、、、、糖蛋白、核蛋白和聚合酶。埃博拉病毒跨膜糖蛋白（transmembrane glycoprotein of the Ebola virus，EBOV-GP）是病毒體表面上唯一在病毒中表達(dá)的蛋白，對于附著于宿主細(xì)胞和催化膜融合至關(guān)重要。因此，EBOV-GP是疫苗的關(guān)鍵組成部分，也是中和抗體以及附著和融合抑制劑的靶點(diǎn)。2016年P(guān)allesen等[2]使用低溫冷凍電鏡技術(shù)成功制備EBOV-GP蛋白晶體，并借助X射線衍射實(shí)驗(yàn)得到其三維結(jié)構(gòu)（PDB ID為5KEN），提供了一種計(jì)算機(jī)高通量虛擬篩選模型，可用于鑒定靶向潛在抑制劑。為了縮短藥物前期研發(fā)周期，本研究采用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，在選定虛擬篩選靶點(diǎn)前提下，采用類藥性評估、分子對接以及吸收、分布、代謝和排泄（absorption、distribution、metabolism and excretion，ADME）預(yù)測等多尺度虛擬篩選策略，然后運(yùn)用進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，從中國臺灣中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫TCM@TAIWAN中篩選潛在的先導(dǎo)化合物，并分析候選分子與靶點(diǎn)的相互作用情況。

1 方法

1.1 資料與計(jì)算方法

分子建模、能量優(yōu)化、類藥性參數(shù)計(jì)算來源CambridgeSoft公司ChemBioOffice 2016；分子對接計(jì)算均采用BIOVIA公司開發(fā)的Discovery Studio 2016的Libdock模塊與CDOCKER模塊、劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心CCDC的GOLD Suite 5.3軟件包；ADME參數(shù)計(jì)算采用Schrodinger 2018的QikProp 模塊；分子動(dòng)力學(xué)模擬及MM/PBSA結(jié)合自由能預(yù)測均采用GROMACS 2019程序包。

1.2 靶蛋白EBOV-GP的預(yù)處理與活性口袋的確定

EBOV-GP介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒內(nèi)在化為內(nèi)體后，GP被宿主半胱氨酸蛋白酶裂解，暴露出受體結(jié)合位點(diǎn)（receptor binding site，RBS），被機(jī)體的免疫監(jiān)視[3]。Onawole等[4]利用AutoDock Vina與FlexX軟件包對MCULE配體庫（包含36 000 000個(gè)小分子）進(jìn)行高通量虛擬篩選，并結(jié)合類藥性及毒理學(xué)預(yù)測，得到3個(gè)候選活性化合物，命名為Hit-SC1、Hit-SC2、Hit-SC3。比較3個(gè)陽性抑制劑與EBOV-GP的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)候選化合物與EBOV-GP活性位點(diǎn)的主要作用力是氫鍵與疏水相互作用，并且在氫鍵發(fā)生作用的關(guān)鍵氨基酸殘基為Glu578、Ser583、Asn586、Thr577和Arg580。如圖1所示，所有殘基位于靶蛋白跨膜區(qū)外側(cè)，均圍繞在病毒糖蛋白三聚體圍繞形成的口袋，一旦有小分子抑制劑進(jìn)入活性口袋區(qū)域，可以有效阻止外來病毒粒子附著并侵入宿主細(xì)胞。位于活性口袋的9個(gè)氨基酸殘基Arg587、Ile590、Leu579、Phe582、Asp127、Leu165、Ile129、Asn98和Thr576與3個(gè)候選活性化合物發(fā)生弱的疏水相互作用或離子鍵。

A-活性口袋示意圖 B-活性部位的關(guān)鍵氨基酸示意圖

以“Ebola virus”“EBOV-GP”為關(guān)鍵詞，檢索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB，查詢EBOV-GP晶體結(jié)構(gòu)，確定適合做虛擬研究的蛋白結(jié)構(gòu)有4個(gè)，依次為6NAE、6HRO、5KEL、5KEN。6NAE與6HRO是跨膜糖蛋白單體結(jié)構(gòu)，5KEL與5KEN是跨膜糖蛋白三聚體結(jié)構(gòu)[2]。目前糖蛋白單體結(jié)構(gòu)是埃博拉病毒虛擬篩選的重要結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)，但是糖蛋白三聚體結(jié)構(gòu)為目前處于臨床試驗(yàn)中的潛在疫苗的主要靶點(diǎn)，已有[5]、[6]、[7]、[8]等多家頂級權(quán)威國際雜志發(fā)文證實(shí)其靶點(diǎn)的重要性，因此本研究選擇埃博拉病毒跨膜糖蛋白三聚體結(jié)構(gòu)形成活性空腔作為虛擬篩選的研究靶點(diǎn)，篩選合適的藥效分子。

基于以上分析，本研究從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID為5KEN），去除結(jié)構(gòu)中附著的中和抗體C2G4（臨床候選免疫治療劑）；使用Schrodinger 2018軟件的Protein Preparation wizard模塊[9]對5KEN結(jié)構(gòu)進(jìn)行修正，在OPLS3力場下對蛋白進(jìn)行能量優(yōu)化，晶體結(jié)構(gòu)重原子RMSD收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.05 nm；使用Receptor Grid Generation模塊[10]計(jì)算包含結(jié)合中心和尺寸的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，得出結(jié)合中心點(diǎn)、、軸的坐標(biāo)分別為159.734 8、159.927 1、156.096 8，結(jié)合空間維數(shù)均為20，所使用的結(jié)合參數(shù)確保整個(gè)靶蛋白活性口袋被封閉在網(wǎng)格中；選擇Asn98、Glu578、Phe582、Ser583、Asn586作為關(guān)鍵氨基酸殘基，并關(guān)注Leu165、Thr576、Thr577、LeuB579、Arg580、Ile590與候選藥效分子是否產(chǎn)生疏水相互作用、離子鍵等。

1.3 中藥分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的預(yù)處理

TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫[11]是目前全世界最大的提供下載虛擬篩選的中醫(yī)藥小分子數(shù)據(jù)庫，由中國臺灣中國醫(yī)藥大學(xué)計(jì)算與系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立，涵蓋443種中藥材的化學(xué)成分以及二維、三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。本研究采用TCM@TAIWAN中36 064個(gè)化合物作為篩選的配體庫，采用Schrodinger 2018的Ligprep模塊對各化合物分子進(jìn)行加氫、能量最小化、幾何優(yōu)化等處理；在力場OPLS3[12]下，計(jì)算pH值為（7.0±2.0）的化合物離子狀態(tài)，搜索合理構(gòu)象作為對接起始構(gòu)象，形成可能的互變異構(gòu)體，并生成批量預(yù)處理文件（*.sdf）；Ahmad等[13]使用同源建模EBOV-GP的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子對接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)，最終找到候選藥效分子胺碘酮，因此本研究將胺碘酮作為陽性對照藥物。

1.4 基于類藥性、分子對接、ADME與結(jié)合自由能預(yù)測的多尺度虛擬篩選

1.4.1 基于類藥性規(guī)則“Lipinski Ro5[14]”“Verber Ro3[15]”的第1輪篩選 對中藥分子配體庫進(jìn)行篩選，挑選出19 981個(gè)符合Lipinski五原則的分子，具備良好的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、潛在的成藥性、較高的口服生物利用度等特質(zhì)。

1.4.2 基于高通量篩選程序LibDock[16]的第2輪篩選 根據(jù)小分子構(gòu)象與受體相互作用熱區(qū)匹配的原理，LibDock將小分子構(gòu)象剛性對接到受體的結(jié)合口袋中，適合于對大規(guī)模數(shù)據(jù)庫進(jìn)行快速精確的虛擬篩選。將EBOV-GP與第1輪篩選得到的19 981個(gè)分子逐一進(jìn)行分子對接，參照打分函數(shù)對所有分子進(jìn)行排序，并以胺碘酮對接打分值作為閾值，最終選擇12 982個(gè)化合物，篩選得到候選分子的LibDock-Score均高于116.77。

1.4.3 基于半柔性對接程序GOLD[17]的第3輪篩選 GOLD源于劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心，具有高度可配置性，可充分利用蛋白質(zhì)-配體系統(tǒng)的背景知識，最大限度地提高對接性能。精確度參數(shù)設(shè)置Very Flexible，評分函數(shù)設(shè)置GoldScore，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值；以胺碘酮對接打分值（?69.79 kJ/mol）作為閾值，最終選擇672個(gè)化合物，篩選得到候選分子的GoldDock-Score均低于?69.79 kJ/mol。

1.4.4 基于高溫動(dòng)力學(xué)柔性對接程序CDOCKER[18]的第4輪篩選 基于分子力場CHARMm[19]的對接程序，采用soft-core potentials以及optional grid representation將配體分子與受體活性位點(diǎn)進(jìn)行對接。首先采用高溫動(dòng)力學(xué)的方法隨機(jī)搜索小分子構(gòu)象，隨后采用模擬退火的方法將各個(gè)構(gòu)象在受體活性位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化，從而產(chǎn)生高精度的對接結(jié)果。對672個(gè)候選分子的CDOCKER_ENERGY進(jìn)行排序，以胺碘酮的對接打分值（?211.25 kJ/moL）作為參考值，選取打分排序前96的分子作為候選分子，其CDOCKER_ENERGY均高于202.13 kJ/moL，與陽性對照藥物的參數(shù)基本一致。

1.4.5 基于ADME篩選 采用Schrodinger的QikProp模塊基于ADME藥動(dòng)學(xué)參數(shù)對96個(gè)候選分子進(jìn)行篩選，除去吸收代謝差的分子。從相對分子質(zhì)量、氫鍵供體、氫鍵配體、溶劑可及表面積、HERG_IC50、水溶性、脂水分配系數(shù)、口服生物利用度等多個(gè)方面預(yù)測評估，共篩選得到32個(gè)候選化合物。

1.4.6 基于MM/GBSA結(jié)合自由能篩選 進(jìn)行MM/GBSA[20]算法優(yōu)化排序，進(jìn)一步提高候選分子與受體蛋白結(jié)合自由能的計(jì)算精度。以胺碘酮與受體蛋白的結(jié)合能（?333.17 kJ/mol）作為閾值，最終選擇8個(gè)候選分子。

1.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

為了從動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)角度分析EBOV-GP蛋白受體與候選抑制劑分子的相互結(jié)合模式，以及靶點(diǎn)-配體對接后構(gòu)象的其他信息隨著時(shí)間變化的具體情況，使用GROMACS 2019[21]進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。EBOV-GP蛋白的拓?fù)鋮?shù)取自Amber的FF03[22]力場，由PDB2GMX工具獲得；小分子抑制劑各原子的部分電荷先用Gaussian 09[23]在HF/6-31G*水平計(jì)算靜電勢，再用Amber中的RESP[24]電荷擬合程序算出；于26.85 ℃對蛋白和小分子配體復(fù)合物進(jìn)行1000步的能量最小化，對優(yōu)化后的體系分別進(jìn)行100 ps的NVT和NPT系綜平衡，限制體系位置；系統(tǒng)溫度保持26.85 ℃，進(jìn)行30 ns的動(dòng)力學(xué)模擬，時(shí)間間隔為2 fs，每隔10 ps保存1次坐標(biāo)軌跡文件；從15～30 ns穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)軌跡中提取150幀動(dòng)力學(xué)軌跡文件，使用MM/PBSA[25]計(jì)算體系穩(wěn)定后的結(jié)合自由能。

2 結(jié)果

2.1 虛擬篩選結(jié)果分析

基于靶點(diǎn)EBOV-GP的三維空間結(jié)構(gòu)，對TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫中的36 064個(gè)天然化合物進(jìn)行多尺度虛擬篩選，最終確定打分排名前4的化合物ZINC85531496、ZINC85567560、ZINC85592968、ZINC33833122作為候選單體，見表1、2。

表1 排名前4的候選化合物與靶點(diǎn)的分子對接打分值與MM/GBSA結(jié)合能

表2 排名前4候選化合物的ADME參數(shù)預(yù)測值

2.2 候選化合物與靶點(diǎn)的相互作用位點(diǎn)分析

采用Discovery Studio Visualizer軟件繪制以氫鍵、疏水相互作用、離子相互作用和水橋等蛋白質(zhì)-配體不同形式相互作用的分子對接結(jié)果。如圖2所示，陽性對照藥物胺碘酮與EBOV-GP之間的主要作用力是常規(guī)氫鍵、鹽橋、alkyl相互作用；與EBOV-GP F鏈氨基酸殘基Arg587、M鏈氨基酸殘基Asn586均形成氫鍵，并且均為常規(guī)氫鍵類型；與EBOV-GP B鏈Glu578、F鏈Glu578、M鏈Glu578均形成鹽橋相互作用；與EBOV-GP空腔的堿性氨基酸殘基M鏈Arg587、M鏈Arg590形成alkyl相互作用；與EBOV-GP F鏈堿性氨基酸Arg587形成π-alkyl堆積作用。

如圖3所示，ZINC85531496與EBOV-GP之間的主要作用力是氫鍵、π-cation相互作用、π-anion相互作用、π-π堆積作用；與EBOV-GP B鏈、F鏈、M鏈氨基酸殘基Ser583、Glu578均形成氫鍵，與B鏈形成2個(gè)常規(guī)氫鍵，與F鏈、M鏈均形成2個(gè)碳?xì)滏I；與EBOV-GP F鏈Glu578、M鏈Glu578均形成π-anion相互作用；與EBOV-GP F鏈Arg580形成π-cation相互作用，與F鏈Phe582形成2個(gè)π-π堆積作用。

如圖4所示，ZINC85567560與EBOV-GP之間的相互作用不僅有氫鍵、范德華力，還有π-π堆積作用、π-anion相互作用、π-alkyl相互作用。ZINC85567560與EBOV-GP氨基酸殘基M鏈Ser583、M鏈和F鏈Glu578形成常規(guī)氫鍵，與B鏈Ser583形成雙碳?xì)滏I，與B鏈Phe582形成π-π堆積作用，與B鏈Glu578形成π-anion相互作用，與F鏈Phe582形成π-alkyl相互作用。

圖2 EBOV-GP與胺碘酮的分子對接

圖3 EBOV-GP與ZINC85531496的分子對接

如圖5所示，ZINC85592968與EBOV-GP之間的相互作用不僅有氫鍵，還有π-anion相互作用與π-alkyl相互作用。ZINC85592968與EBOV-GP M鏈Thr577形成常規(guī)氫鍵，與M鏈Glu578、B鏈Ser583、M鏈Ser583、B鏈Phe582、F鏈Glu578、F鏈Ser583均形成1個(gè)碳?xì)滏I，與B鏈Glu578形成π-anion相互作用，與M鏈Arg580、Leu579分別形成π-alkyl相互作用。

如圖6所示，ZINC33833122與EBOV-GP之間的相互作用不僅有氫鍵，還有π-anion相互作用與π-alkyl相互作用。ZINC33833122與EBOV-GP B鏈Thr577形成常規(guī)氫鍵，與M鏈Glu578、B鏈Ser583、M鏈Ser583、B鏈Phe582、F鏈Glu578、F鏈Ser583均形成1個(gè)碳?xì)滏I，與B鏈Glu578形成π-anion相互作用，M鏈Arg580、Leu579分別形成π-alkyl相互作用。這些作用力使結(jié)合能降低，親和力增加，候選單體與EBOV-GP三聚體空腔部位緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，可以有效阻止外來病毒粒子附著并侵入宿主細(xì)胞。

圖5 EBOV-GP與ZINC85592968的分子對接

圖6 EBOV-GP與ZINC33833122的分子對接

氫鍵在生物大分子中起著重要作用，氫鍵是蛋白質(zhì)與配體相互作用的主要推動(dòng)力之一，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物方面起著不可或缺的作用[26]。胺碘酮與EBOV-GP氨基酸殘基Arg587、Asn586形成氫鍵相互作用，產(chǎn)生的氫鍵數(shù)目為2個(gè)；4個(gè)候選單體均與EBOV-GP氨基酸殘基Glu578、Ser583形成氫鍵相互作用，甚至形成雙氫鍵，這些殘基均是候選單體的氫鍵受體，并且常規(guī)氫鍵與碳?xì)錃滏I總數(shù)均≥5（其中ZINC85531496、ZINC85567560、ZINC85592968、ZINC33833122氫鍵總數(shù)分別為6、5、6、5個(gè)）。胺碘酮與EBOV-GP氨基酸殘基Glu578形成鹽橋相互作用，與堿性氨基酸殘基Arg587、Arg590形成alkyl相互作用，與堿性氨基酸Arg587形成π-alkyl堆積作用。4個(gè)候選單體均與EBOV-GP氨基酸殘基Glu578形成π-anion相互作用，與堿性氨基酸Arg580或Leu579形成π-alkyl相互作用，這些相互作用在候選配體分子與EBOV-GP三聚體圍繞形成的結(jié)合腔的殘基結(jié)合中起到輔助作用?？傮w而言，與陽性對照藥物胺碘酮相比，4個(gè)候選分子與EBOV-GP的結(jié)合更加具有優(yōu)勢，均具有更強(qiáng)的相互作用，推測可能具有更高的抑制作用。

2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

如圖7所示，15 ns后所有體系的均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）波動(dòng)值均穩(wěn)定在0.1 nm以下，模擬的分子動(dòng)力學(xué)模擬體系均達(dá)到平衡狀態(tài)，表明模擬結(jié)果可用于進(jìn)一步分析。

通過計(jì)算化合物與受體蛋白復(fù)合物氨基酸骨架原子在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中的均方根波動(dòng)值（root mean square fluctuation，RMSF），分析EBOV-GP與4種候選化合物骨架氨基酸在模擬過程中的波動(dòng)性。如圖8所示，ZINC85531496-GP、ZINC85567560-GP、ZINC85592968-GP、ZINC33833122- GP氨基酸波動(dòng)變化趨勢與蛋白質(zhì)受體APO大致相似，在氨基酸555～595區(qū)間出現(xiàn)較低的波動(dòng)性（RMSF＜0.15 nm），且ZINC85531496-GP與ZINC33833122-GP的波動(dòng)性明顯低于蛋白質(zhì)受體APO；ZINC85531496-GP、ZINC85567560-GP、ZINC85592968-GP在氨基酸520～530、540～550區(qū)間出現(xiàn)大幅波動(dòng)（RMSF＞0.15 nm），其中ZINC85531496-GP、ZINC85592968-GP波動(dòng)幅度明顯高于蛋白質(zhì)受體APO，ZINC85567560-GP與蛋白質(zhì)受體APO具有相似的波動(dòng)軌跡；ZINC33833122- GP的氨基酸波動(dòng)變化趨勢不同其他3個(gè)體系，氨基酸538～545區(qū)間出現(xiàn)極高的波動(dòng)峰值（RMSF＞0.3 nm）。以上4個(gè)配體-靶蛋白復(fù)合物體系中RMSF波動(dòng)較小的氨基酸與關(guān)鍵氨基酸相吻合，可能與化合物和EBOV-GP之間產(chǎn)生了較穩(wěn)定的氫鍵、疏水作用或π-π堆積作用有關(guān)，可以將化合物與結(jié)合口袋周圍的關(guān)鍵氨基酸殘基側(cè)鏈相互連接在一起，形成較穩(wěn)定的三聚體復(fù)合物；波動(dòng)幅度較大的區(qū)域位于蛋白單體與單體結(jié)合的鉸鏈區(qū)，增加了抗原表位的異質(zhì)性，更加易于和抗體蛋白結(jié)合。

圖7 EBOV-GP的氨基酸骨架原子隨時(shí)間變化的RMSD值

圖8 配體-蛋白復(fù)合物氨基酸骨架原子的RMSF值波動(dòng)圖

進(jìn)一步研究ZINC85531496、ZINC85567560、ZINC85592968、ZINC33833122與EBOV-GP之間的結(jié)合親和力，采用MM/PBSA方法計(jì)算4種化合物與EBOV-GP復(fù)合物的結(jié)合自由能，分析4種化合物與EBOV-GP結(jié)合的作用。如表3所示，范德華力與靜電勢能最有利于4種化合物與EBOV-GP結(jié)合，表面溶劑化作用也有利于結(jié)合，但與范德華力和靜電勢能的數(shù)值相比作用較弱；極性溶劑化作用不利于體系結(jié)合。ZINC85592968與ZINC85567560具有較強(qiáng)的范德華力，但由于ZINC85592968具有最弱的靜電勢能，導(dǎo)致其最終的結(jié)合自由能不占優(yōu)勢，排名第3；ZINC85531496與ZINC33833122具有近似的范德華力數(shù)值，但ZINC33833122具有較高的極性溶劑化作用，非常不利于配體與受體結(jié)合，因此與蛋白質(zhì)結(jié)合過程中由于溶劑中的極性溶劑化相互作用很大程度上抵消了靜電勢能與范德華力之和，導(dǎo)致其最終的結(jié)合自由能排名最低；ZINC85531496與ZINC85567560的非極性相互作用更有利于配體和受體的結(jié)合，其中范德華力與靜電勢能均起主導(dǎo)作用，均有利于配體與受體的結(jié)合，并且極性溶劑化作用產(chǎn)生的負(fù)作用較弱，這也是ZINC85531496、ZINC85567560與EBOV-GP結(jié)合自由能具有優(yōu)勢效應(yīng)的關(guān)鍵因素。

表3 4種候選化合物與EBOV-GP的MM/PBSA結(jié)合自由能

結(jié)合自由能數(shù)值越小，表示結(jié)合所需能量越低，越有利于配體與蛋白的結(jié)合。通過比較4種化合物與EBOV-GP的結(jié)合自由能，得出蛋白配體結(jié)合強(qiáng)弱關(guān)系為ZINC85531496-GP＞ZINC85567560-GP＞ZINC85592968-GP＞ZINC33833122-GP，與分子對接結(jié)果一致。

3 討論

EBOV最初在西非局部地區(qū)反復(fù)爆發(fā)，2014年蔓延至整個(gè)西非，造成超過11 000人死亡。剛果民主共和國作為第2大流行國家，已報(bào)道2264人死亡，EBOV為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[27]。針對EBOV的疫苗或藥物的研發(fā)仍處于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)或人體臨床初試階段。臨床試驗(yàn)中的候選免疫治療劑ZMapp?，包含2個(gè)EBOV-GP的特異性抗體（c2G4、c4G7）和1個(gè)GP/SGP-交叉反應(yīng)抗體（c13C6），ZMapp?的制備既昂貴又費(fèi)時(shí)，并且其抗體表位之間的差異以及有效免疫的詳細(xì)機(jī)制仍然難以確定，尚未經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其有效性[10]。目前EBOV相關(guān)疫苗和藥物的研發(fā)圍繞跨膜糖蛋白三聚體GP結(jié)構(gòu)，主要包括GP1（受體結(jié)合）和GP2（病毒融合）2個(gè)亞基，EBOV-GP的C末端區(qū)域包含381個(gè)氨基酸，可以組裝成高度糖基化的黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域（mucin-like domain，MLD），介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞，因此，EBOV-GP為重要的藥物靶點(diǎn)[28]。

EBOV-GP是絲狀病毒科I類融合蛋白，由二硫鍵互連的GP1與GP2 2個(gè)亞基組成，在病毒體表面上形成同型三聚體活性分子。GP1由核心顆粒、聚糖帽和MLD 3部分組成，GP2包含膜融合結(jié)構(gòu)域，并錨定在膜上。EBOV-GP是一種動(dòng)態(tài)元件，從融合前的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象不可逆轉(zhuǎn)地折疊成融合后的穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，從而驅(qū)動(dòng)病毒與宿主細(xì)胞融合。融合過程需要5個(gè)重要條件：①與細(xì)胞表面受體（如TIM-1、Axl、硫酸乙酰肝素及DC-SIGN）結(jié)合；②胞飲作用；③組織蛋白酶在低pH下裂解GP；④結(jié)合內(nèi)體中NPC1膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；⑤驅(qū)動(dòng)GP發(fā)生膜融合所需的構(gòu)象變化。其中驅(qū)動(dòng)GP發(fā)生膜融合所需的構(gòu)象變化是最有可能的最終觸發(fā)關(guān)鍵因素，因此有效抑制EBOV-GP構(gòu)象轉(zhuǎn)變可以阻斷病毒與宿主細(xì)胞融合。

本研究基于EBOV-GP的三維空間結(jié)構(gòu)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)從TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫中尋找抗病毒的中藥活性分子。Ahmad等[13]僅采用Auto Dock Vina與Flex-X 2種分子對接軟件從Mcule化合物庫（https://mcule.com/database/）進(jìn)行虛擬篩選，ADME藥動(dòng)學(xué)評價(jià)僅使用ADMET-SAR進(jìn)行過濾。本研究在此基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)方法，優(yōu)化虛擬篩選的精度。

首輪篩選遵循類藥性指標(biāo)Lipinski Ro5、Verber Ro3作為通過篩選大型化學(xué)結(jié)構(gòu)文庫表征命中規(guī)則的重要標(biāo)準(zhǔn)，違反1種以上類藥性參數(shù)的化合物可能存在生物利用度問題，因此16 083種化合物被剔除，挑選出19 981種化合物。隨后第2輪篩選采用業(yè)界公認(rèn)的3種分子對接軟件LibDock、GOLD、CDOCKER進(jìn)行低-中-高3種精度的虛擬篩選，逐步縮小候選化合物庫的規(guī)模，極大地提高了計(jì)算精度，盡可能降低虛擬篩選假陽性率。隨后第3輪篩選采用Schrodinger軟件的QikProp模塊來完成ADME參數(shù)預(yù)測，較ADMET-SAR進(jìn)行過濾策略，篩選規(guī)則新增了肝毒性、口服生物利用度2項(xiàng)關(guān)鍵ADMET指標(biāo)，并考慮了Lipinski Ro5、Verber Ro3 2項(xiàng)類藥性指標(biāo)，使得本研究的ADME評價(jià)體系更加客觀、系統(tǒng)、精準(zhǔn)。為了模擬0.9%氯化鈉溶液中靶點(diǎn)蛋白與命中分子的結(jié)合模式，本研究采用高性能GPU加速技術(shù)進(jìn)行了30 ns時(shí)長的分子動(dòng)力學(xué)模擬，并使用MM/GBSA和MM/PBSA 2種算法計(jì)算命中分子與靶點(diǎn)的結(jié)合自由能，與常規(guī)的分子對接后結(jié)合能結(jié)果相比較，富集精準(zhǔn)度被大幅提升。本研究尚處于藥物開發(fā)的前期階段，缺乏抗病毒活性驗(yàn)證、藥動(dòng)學(xué)評估等數(shù)據(jù)支撐，后期將聯(lián)合專業(yè)病毒學(xué)研究平臺，開展相關(guān)生物學(xué)活性驗(yàn)證及安全性評價(jià)。

綜上，本研究創(chuàng)新地采用多種計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)挖掘中藥來源的抑制劑分子，ZINC85531496、ZINC85567560、ZINC85592968、ZINC33833122能夠有效結(jié)合EBOV-GP，抑制其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而阻斷病毒與宿主細(xì)胞膜融合，為從天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中挖掘阻斷埃博拉病毒侵染人體的先導(dǎo)化合物提供一定參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mining antiviral active inhibitors in traditional Chinese medicine targeted with transmembrane glycoprotein of Ebola virus bydiscovery

SHI Hai-long, SHI Yong-heng, WANG Chuan, CHENG Yi, HUANG Yue, LIU Ji-ping, WANG Bin

Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

Using computer virtual screening technology, some inhibitors of transmembrane glycoprotein of Ebola virus (EBOV-GP) would be sorted from TCM@TAIWAN Database.Taking EBOV-GP as the target, using multi-scale virtual screening strategies such as drug-like evaluation, molecular docking, ADME prediction, molecular dynamics simulation, etc., the candidates were mined from TCM@TAIWAN database, and then the interaction between candidates and targets was analyzed.Amiodarone was used as a positive control, and four monomers (ZINC85531496, ZINC85567560, ZINC85592968 and ZINC33833122) from Chinese medicine with good drug-like properties were selected, and their affinity and interaction with EBOV-GP were superior to amiodarone.A variety of computer virtual screening technologies to mine EBOV-GP inhib are used to facilitate the extraction, design, and experimental synthesis of anti-Ebola virus inhibitors from natural products chemical structure database.

Ebola virus; transmembrane glycoprotein; virtual screening; Chinese medicine; antiviral active molecule

R285.51

A

0253 - 2670(2021)13 - 3933 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.017

2020-11-30

陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題（JCMS003）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2019JQ-401）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-YL13）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201910716031）

史海龍（1981—），男，博士，美國UNMC博士后，研究方向?yàn)橛?jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及生物大分子模擬。Tel: 15829489958 E-mail: shl112@sntcm.edu.cn

王 斌，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事防治心腦血管疾病的方藥研究。E-mail: wangbing812@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]