裝載黃芩苷的溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠的制備及表征

姜玉勤，陸 迅，孫曉怡，唐余燕，劉何晶，劉 揚，魏明剛*

裝載黃芩苷的溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠的制備及表征

姜玉勤1，陸 迅2，孫曉怡1，唐余燕1，劉何晶1，劉 揚3，魏明剛1*

1. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006 2. 蘇州市立醫(yī)院北區(qū)，江蘇 蘇州 215000 3. 蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215123

基于蛋白-多糖納米凝膠的制備技術(shù)，通過低相對分子質(zhì)量殼聚糖對溶菌酶的修飾以及對環(huán)境因素的調(diào)節(jié)篩選，控制溶菌酶的自組裝行為，制備一種綠色環(huán)保的具備核殼結(jié)構(gòu)的溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠，從而達到減小粒徑，提高包封率和載藥量的目的，使其更有利于腎靶向。利用Maillard反應(yīng)將溶菌酶與低相對分子質(zhì)量殼聚糖按不同比例合成溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖枝接物，通過SDS-PAGE蛋白電泳來優(yōu)選出產(chǎn)量最高的合成比例；對合成的產(chǎn)物進行內(nèi)源熒光、紫外測定等表征，并通過2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）法測定接枝率；以粒徑為評價指標，對溶菌酶濃度，反應(yīng)體系pH值、加熱溫度等條件進行篩選優(yōu)化，得到空白納米凝膠最佳合成條件；選取適宜的載藥方法，得到了載黃芩苷納米凝膠。合成納米凝膠的最佳工藝為溶菌酶與低相對分子質(zhì)量殼聚糖比例1∶2、反應(yīng)體系pH值11、溶菌酶-殼聚糖接枝物質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL、加熱溫度71 ℃、加熱時間51 min。得到的溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖枝接物接枝率為（24.7±2.9）%，空白納米凝膠的粒徑范圍為16～120 nm、平均粒徑為49.02 nm、PDI為0.132，載黃芩苷納米凝膠的包封率為（95.00±2.54）%、載藥量為（17.00±1.26）%。通過Maillard合成了溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠，并找到了最優(yōu)的合成工藝。制備的納米凝膠包封率高，粒徑小，分布均勻，緩釋效果明顯。

溶菌酶；低相對分子質(zhì)量殼聚糖；黃芩苷；Maillard反應(yīng)；自組裝納米凝膠；腎靶向；SDS-PAGE

靶向給藥系統(tǒng)（targeted drug delivery system，TDDS）是使藥物能到達靶器官、靶細胞，甚至細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，并要求有一定濃度的藥物停留相當長的時間，以更好地發(fā)揮藥效的給藥系統(tǒng)。臨床上用于腎臟疾病的藥物因長期用藥，而且靶向性不強，多數(shù)具有較大的毒性[1]。為了減少不良反應(yīng)并提高藥物生物利用度，腎靶向給藥系統(tǒng)的研究成為人們關(guān)注的重點。

納米凝膠（nanoparticles）納米凝膠是由親水性或兩親性高分子鏈組成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它能顯著的溶脹于水但是不溶解于水，由于水和凝膠網(wǎng)絡(luò)的親和性，水可能以束縛水和自由水等形式存在于高分子網(wǎng)絡(luò)中而失去流動性，因此納米凝膠能夠保持一定的形狀。它們可以作為一種藥物載體，而且也可以通過鹽鍵、氫鍵或者疏水作用自發(fā)的結(jié)合一些生物活性分子[2-3]。溶菌酶（lysozyme，LZM）和殼聚糖都是優(yōu)良的生物分子材料，具有良好的生物特性和機械性能，是比較熱門的研究對象。

溶菌酶在適當條件下，可與多糖在酸或熱誘導下形成納米凝膠，并在藥物運輸體系中發(fā)揮重要作用[4]。溶菌酶屬于低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)（low molecular weight protein，LMWP），LMWP相對分子質(zhì)量比藥物大，能夠控制所結(jié)合藥物的動力學性質(zhì)：可以經(jīng)腎小球濾過，并被腎近曲小管細胞重吸收。藥物與LMWP形成的復合物能夠很快離開循環(huán)系統(tǒng)，而濃集于近曲小管細胞。在細胞中，LMWP被轉(zhuǎn)運到具有蛋白水解活性的溶酶體中，被水解代謝為短肽和小分子氨基酸，所載藥物可被活化和釋放出來[5]。

藥物可直接通過末端羧基與溶菌酶的賴氨酸相連，也可通過不同的間隔基團，如酸敏感間隔基、寡肽、α-羥基酸、鉑（II）通用聯(lián)動系統(tǒng)（ULS）和pH敏感的順-烏頭堿間隔基與之間接相連[6]。殼聚糖為帶陽離子的高分子堿性多糖聚合物，聚合物脫乙?；》肿託ぞ厶牵╨ow molecular weight chitosan，LMWC）既有生物相容性又有生物可降解性，近年來已經(jīng)成功應(yīng)用于腎靶向載體系統(tǒng)中[7]。

研究表明低相對分子質(zhì)量殼聚糖和溶菌酶是作為配體與近端腎小管Megalin和Cubilin受體結(jié)合而實現(xiàn)靶向[8]的作用，本實驗旨在探究通過低相對分子質(zhì)量殼聚糖對溶菌酶的修飾以及對環(huán)境因素的調(diào)節(jié)篩選，控制溶菌酶的自組裝行為，制備一種綠色環(huán)保的具備核殼結(jié)構(gòu)的溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠，從而減小納米凝膠粒徑，提高包封率和載藥量，使其更有利于腎靶向。

黃芩苷作為黃酮類化合物，具有抗炎、調(diào)血脂、抗氧化等廣泛的生物活性，在體外可通過阻斷脂多糖誘導的血管內(nèi)皮細胞核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-kB）活化發(fā)揮抗炎作用[9]。實驗發(fā)現(xiàn)在大鼠制模同時給予灌胃黃芩苷可降低體內(nèi)血脂指標，抑制NF-kB活化，減少人巨噬細胞趨化蛋白-1（human macrophage chemoattractant protein-1，MCP- 1）分泌，表明黃芩苷能較好地改善脂質(zhì)代謝紊亂，減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對預(yù)防腎小球腎炎，延緩早期腎小球腎炎病理損害及保護腎臟功能具有重要意義[10]。

基于納米凝膠的優(yōu)越性，本實驗通過低相對分子質(zhì)量殼聚糖對溶菌酶的修飾以及對環(huán)境因素的調(diào)節(jié)篩選，制備出一種綠色環(huán)保的具備核殼結(jié)構(gòu)的溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠（圖1），對其進行表征，并選取適宜方法將模型藥物黃芩苷包封于其內(nèi)部，發(fā)現(xiàn)溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠給藥系統(tǒng)具有較高包封率和載藥量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Min-Protean垂直電泳儀，美國伯樂有限公司；DHG-9023A烘箱，上海精宏實驗室設(shè)備有限公司；CHEMIDOC粒成像儀，BIO-RAD公司；UV-2600紫外分光光度計，日本島津精密儀器公司；LS55熒光分光光度計，珀金埃爾默儀器有限公司；Model410圓二色譜儀，美國AVIV公司；Zetasizer Nano ZS90納米凝膠度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文有限公司，H-600透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司。

圖1 研究總思路

1.2 藥品與試劑

低相對分子質(zhì)量殼聚糖，批號PH170210，平均相對分子質(zhì)量＜5000，上海笛柏化學品技術(shù)有限公司；溶菌酶，批號20201025，質(zhì)量分數(shù)大于98%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；考馬斯亮藍R250，上海金穗生物科技有限公司；蛋白電泳試劑盒、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，批號151026），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；KBr（批號HZB50C）、磷酸二氫鈉（批號113091013）、檸檬酸（批號90311）、檸檬酸鈉（批號153269），國藥集團化學試劑有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）試劑盒，批號HZB50C，東京化成工業(yè)株式會社；黃芩苷，批號PC20170510，質(zhì)量分數(shù)＞98%，南京都萊生物技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 復合物的制備

殼聚糖與溶菌酶的反應(yīng)是通過Maillard反應(yīng)來完成的[11]。Maillard反應(yīng)也稱羰氨反應(yīng)，它是醛、酮、還原糖以及脂肪氧化生成的羰基化合物與胺類、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)甚至氨水中的氨基之間的反應(yīng)[12]。本實驗利用蛋白質(zhì)溶菌酶ε-氨基與LMWC還原性末端羰基之間發(fā)生的自發(fā)Maillard反應(yīng)，將蛋白與多糖偶聯(lián)成一體，得到LZM-LMWC復合物。具體操作是將溶菌酶和LMWC的混合物以0.10 g/mL質(zhì)量濃度溶解于水中并冷凍干燥得到二者的混合粉末。將混合粉末在底部含有飽和KBr溶液的干燥器中（此時的相對濕度為79%），在相對濕度79%、60 ℃下反應(yīng)4 d[13]。反應(yīng)過程見圖2。

圖2 LZM-LMWC反應(yīng)流程

2.2 溶菌酶與LMWC最優(yōu)混合物質(zhì)的量比篩選

將溶菌酶和LMWC按混合物質(zhì)的量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例，按上述合成方法合成，后將反應(yīng)后的物質(zhì)用去離子水溶解，用截留相對分子質(zhì)量為14 000的透析袋對復合物進行透析，除去游離的溶菌酶和LMWC，透析72 h，后用SDS-PAGE電泳法對復合物含量進行檢測。根據(jù)溶菌酶和殼聚糖的相對分子質(zhì)量，選擇15%的分離膠，上樣量為20 μL，濃縮膠電壓80 V，分離膠調(diào)節(jié)電壓為120 V，當?shù)鞍譓arker條帶即將到達底部的時候，停止電泳，后進行染色和脫色。電泳后通過Bandscan軟件程序?qū)Ω呦鄬Ψ肿淤|(zhì)量條帶和低相對分子質(zhì)量條帶的灰度進行觀察分析。

如圖3所示，各比例條件下，LZM-LMWC的合成產(chǎn)率基本都隨著反應(yīng)時間（1～4 d）的增加而不斷增加，且合成產(chǎn)率最高的比例為1∶2，所以選取溶菌酶與LMWC的混合物質(zhì)的量比為1∶2的產(chǎn)物作為納米凝膠的制備原料。

2.3 LZM-LMWC復合物的表征測定

2.3.1 紫外-可見吸收光譜測定 將復合物LZM- LMWC（溶菌酶與LMWC物質(zhì)的量比1∶2）、物理混合物（溶菌酶與LMWC物質(zhì)的量比1∶2）、LMWC和溶菌酶分別用水稀釋至0.1 mg/mL，使用紫外分光光度計對樣品掃描，波長范圍為150～400 nm，結(jié)果圖4。比較圖4可見，物理混合物在150～400 nm的吸收為溶菌酶和LMWC吸收的疊加，溶菌酶與LMWC反應(yīng)后的紫外吸收光譜在260～280 nm處的吸收峰已不明顯，吸收峰的幾乎消失說明可能有新的化合物的形成，此時溶菌酶與LMWC已經(jīng)處于結(jié)合狀態(tài)。同時，210～225 nm處的吸收峰移至230 nm附近。吸收峰紅移，吸收強度減弱，這可能與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

2.3.2 圓二色性光譜（CD）測定 天然溶菌酶與LZM-LMWC（1∶2）分別溶于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為30 μg/mL的樣品液，分別取適量樣品液于光徑為0.1 cm的比色池中，使用圓二色譜儀進行檢測，環(huán)境溫度為25℃，樣品掃描波長范圍190～250 nm，掃描速率100 nm/min，譜帶寬度1.0 nm，靈敏度為20 mdeg，響應(yīng)時間為0.25 s。圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白差減，可計算樣品的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲二級結(jié)構(gòu)的百分含量。如圖5所示，溶菌酶在200 nm正峰處具有最高橢圓率，表明溶菌酶的天然結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，在210～215 nm處有最低橢圓率。合成的LZM- LMWC接枝物正峰位置及負峰位置改變不明顯，CD圖分析的蛋白質(zhì)不同二級結(jié)構(gòu)的比例變化如表1所示。在LZM-LMWC的合成過程中，溶菌酶的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋比例在降低，β-折疊與無規(guī)則卷曲比例升高，可能在60 ℃的加熱條件下α-螺旋少量的轉(zhuǎn)化為了β-折疊與無規(guī)則卷曲，這與蛋白質(zhì)的變性有關(guān)。

圖3 溶菌酶與LMWC不同混合物質(zhì)的量比(1∶1, A; 1∶2, B; 1∶3, C; 1∶4, D)合成的反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖

圖4 復合物LZM-LMWC和物理混合物的紫外吸收圖

圖5 溶菌酶和LZM-LMWC的遠紫外CD圖

表1 溶菌酶和LZM-LMWC的不同二級結(jié)構(gòu)的比例

2.3.3 內(nèi)源熒光測定 溶菌酶與LMWC合成后產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，褐變是糖基化反應(yīng)的顯著特征。褐變的結(jié)果是有色物質(zhì)的產(chǎn)生，研究表明熒光物質(zhì)是有色物質(zhì)的前體物。因此，通過對比反應(yīng)前后物質(zhì)的熒光強度可證實溶菌酶與LMWC發(fā)生了接枝反應(yīng)。以0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑配制1.0 mmol/L的溶菌酶標準溶液備用，LZM-LMWC使用相同的溶液配成1.0 mmol/L的標準溶液備用。在激發(fā)和發(fā)射光柵狹縫均為5 nm，激發(fā)波長為280 nm條件下，掃描一定波長范圍內(nèi)溶菌酶和LZM-LMWC的熒光光譜。由圖6可見，與溶菌酶相比，復合物在340 nm處的熒光強度增大，證實了溶菌酶與LMWC發(fā)生了接枝反應(yīng)。

2.3.4 復合物接枝度測定 采用2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）法測定溶菌酶糖基化反應(yīng)前后自由氨基的含量，從而推算出復合物的接枝度。取1 mL蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液分別與1 mL的NaHCO3溶液（0.04 g/mL）、SDS溶液（0.10 g/mL）與TNBS溶液（1 mg/mL）混合。隨后置于40 ℃的水浴鍋中避光反應(yīng)2 h，依次加入0.5 mL 1 mol/L的HCl和5 mL 0.01 mol/L HCl以終止反應(yīng)。冷卻后立即在340 nm處測定樣品溶液的吸光度（）。利用接枝度的計算公式計算載體的接枝度為（24.7±2.9）%。

圖6 溶菌酶和LZM-LMWC的內(nèi)源熒光圖

接枝度＝1－樣白/白樣

樣與白分別為接枝共聚物和溶菌酶的，樣與白分別為接枝共聚物和溶菌酶的蛋白質(zhì)量濃度

2.4 空白納米凝膠制備工藝的考察

球狀蛋白質(zhì)加熱膠化理論是本實驗選取的合成方法依據(jù)的最根本的理論，對于常見的蛋白質(zhì)分子來說，加熱變性膠化是一個非常重要的性質(zhì)。球狀蛋白質(zhì)在不加入交聯(lián)劑的情況下，通過控制反應(yīng)物的濃度、pH值、加熱溫度及加熱時間即可得到穩(wěn)定的固態(tài)膠體。因此，以空白納米凝膠粒徑及聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）為評價指標，選取反應(yīng)體系pH值、接枝物的質(zhì)量濃度、加熱溫度及加熱時間進行單因素實驗及中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）實驗考察。

2.4.1 pH值對粒徑的影響 控制反應(yīng)物的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為45 min，在不同pH值的緩沖液中進行合成。在pH值為11緩沖體系中，粒徑分布更集中，粒徑也更小。所以選取pH值為11的Na2CO3-NaOH緩沖液作為納米凝膠合成的反應(yīng)體系。圖7中明顯可以看出在pH值為11緩沖體系中，粒徑分布更加集中，粒徑也更加小。所以選取pH值為11的Na2CO3-NaOH緩沖液作為納米凝膠合成的反應(yīng)體系。

2.4.2 溶菌酶-殼聚糖質(zhì)量濃度對粒徑影響 控制反應(yīng)體系pH值為11，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時間為45 min，選取質(zhì)量濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.1 mg/mL的LZM-LMWC接枝物合成空白納米凝膠。所得空白納米凝膠粒徑分別為69.8、69.1、69.1、69.2、90.0、115.6、140.3、162.3、218.7 nm。可見，隨著溶菌酶-殼聚糖質(zhì)量濃度的降低，納米凝膠的粒徑不斷降低，當溶菌酶-殼聚糖質(zhì)量濃度過低時，合成體系中的粒子數(shù)過低，質(zhì)量濃度達到0.6 mg/mL后，質(zhì)量濃度對粒徑的影響不大。所以最終選取溶菌酶-殼聚糖質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL作為納米凝膠合成的條件。

圖7 合成體系pH值9～11時的粒徑分布圖

2.4.3 加熱溫度和時間對粒徑的影響 控制反應(yīng)體系pH值為11，LZM-LMWC接枝物質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL，加熱時間為45 min，加熱溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70、80、90 ℃合成空白納米凝膠。所得空白納米凝膠粒徑分別為133.4、145.2、153.2、126.7、97.6、180.3、121.0 nm。可見，加熱溫度對納米凝膠的粒徑影響較為顯著，在70 ℃時得到的納米凝膠粒徑最最小。

隨后控制反應(yīng)體系pH值為11，LZM-LMWC接枝物質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL，加熱溫度為70 ℃，加熱時間分別設(shè)置為30、40、50、60 min合成空白納米凝膠。所得空白納米凝膠粒徑分別為125.7、137.5、114.3、116.8 nm?？梢?，加熱時間對空白納米凝膠粒徑的影響并不顯著，在加熱時間30～60 min，粒徑的變化并無太大波動。

2.4.4 空白納米凝膠的制備條件多因素CCD考察 根據(jù)CCD的中心組合實驗原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取反應(yīng)體系pH值（1）、反應(yīng)物的質(zhì)量濃度（2）、加熱溫度（3）和加熱時間（4）為響應(yīng)面的自變量，粒徑大?。ǎ橹笜耍瑢嶒炓蛩厮?、實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

根據(jù)實驗?zāi)Ｐ蛿M合結(jié)果及軟件統(tǒng)計結(jié)果，可以得到最終響應(yīng)面的二次方程為＝41.97＋0.321＋16.892＋0.613＋13.344－0.8712－0.9513＋0.1814－2.9423＋5.4424－5.8134＋9.6212＋7.3622＋19.8832＋5.8642。

回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。＜0.05表明考察因素對于響應(yīng)值具有顯著性。進一步分析各方程中的各項，1、2、3、4對均有顯著性影響。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件繪制不同考察因素對于各響應(yīng)值的3D響應(yīng)面圖（圖8）。3D響應(yīng)面圖可用來評價各考察因素之間的交互作用以及確定各因素的最佳范圍。

通過Design-Expert 8.0.6軟件的優(yōu)化模塊，得到空白納米凝膠制備的最優(yōu)反應(yīng)條件為pH值11，質(zhì)量濃度0.6 mg/mL，溫度為71 ℃，反應(yīng)時間為51 min；納米凝膠的平均粒徑68.28 nm。

表2 響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計及結(jié)果

表3 CCD實驗設(shè)計方差分析

按照上述最優(yōu)處方條件制備3批溶菌酶- LWMC空白納米凝膠，測定納米凝膠粒徑、載藥量及包封率，結(jié)果見表4，平均粒徑為69.13 nm，載藥量15.79%，包封率94.78%，RSD在2%以內(nèi)，表明驗證結(jié)果良好，制備工藝穩(wěn)定。

2.5 LZM-LMWC空白納米凝膠（LZM-LMWC- NPs）的制備及表征

2.5.1 LZM-LMWC-NPs的制備 根據(jù)上述實驗結(jié)果，確定LZM-LMWC-NPs的合成方法為將LZM- LMWC溶解于去離子水中配成0.6 mg/mL的溶液，在25 ℃下用超聲溶解儀使接枝物充分溶解分散。用0.1 mol/L NaOH-Na2CO3緩沖液緩慢調(diào)節(jié)溶液pH值至11，隨后放置在71 ℃恒溫水浴中孵育51 min，用冰浴終止反應(yīng)。之后，將產(chǎn)物在截留相對分子質(zhì)量為14 000的透析袋中透析3 d，去除殘留的單體及其他雜質(zhì)。透析完成后，將產(chǎn)物放在真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h去除水分，獲得干燥的納米凝膠溫室保存。

表4 最優(yōu)條件的驗證結(jié)果

2.5.2 LZM-LMWC-NPs的表征 采用H-600透射電子顯微鏡觀察LZM-LMWC-NPs形態(tài)近為球形，粒徑大小分布較均一，如圖9。粒徑范圍為16～120 nm，平均粒徑為49.02 nm，PDI為0.132，說明粒徑分散性良好，見圖10。

圖9 LZM-LMWC-NGs的TEM圖

圖10 LZM-LMWC-NGs粒徑分布

2.6 黃芩苷-溶菌酶-低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米凝膠（baicalin-lysozyme-low molecular weight chitosan- lysozyme-nanogels，BA-LZM-LMWC-NPs）的制備

2.6.1 載黃芩苷納米凝膠制備 取0.1 g制備好的LZM-LMWC-NGs復溶分散在10 mL去離子水中，超聲震蕩15 min后緩慢加入用乙醇溶解的黃芩苷，于磁力攪拌器攪拌，用Na2CO3-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值為8～9，滴完黃芩苷溶液后繼續(xù)攪拌10 min。在溫度為60 ℃的條件下加熱40 min后將混合物小心地轉(zhuǎn)移到離心管中，并以12 000 r/min的速度離心20 min，移去含有未裝載黃芩苷的上清液，小心收集底層物質(zhì)并將其分散在去離子水中，獲得裝載有黃芩苷的納米凝膠，即BA-LZM- LMWC-NPs，將其在冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，干燥完成后密封保存。

2.6.2 黃芩苷體外測定方法的建立 紫外掃描顯示，黃芩苷有244、278、315 nm處3個吸收峰，其中278 nm波長處有最大吸收，所以選定278 nm作為黃芩苷的測定波長。

實驗測定黃芩苷回歸曲線方程＝0.030 6－0.006 7，2＝0.999 9，線性范圍1～32 μg/mL。取1、8、32 μg/mL高、中、低3個不同質(zhì)量濃度樣品溶液，分別在1 d內(nèi)5個固定時間點對其值進行測定。并連續(xù)5 d進行，然后計算1 d內(nèi)和5 d內(nèi)的RSD。高、中、低3個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.98%、0.96%、0.55%和1.86%、1.52%、0.88%，RSD均＜2%，表明該方法精密度良好。

2.6.3 BA-LZM-LMWC-NPs包封率和載藥量的測定 實驗采用高速離心的方法測定BA-LZM- LMWC-NPs的包封率。取適量制備好干燥的BA- LZM-LWMC-NPs粉末，向其中加入0.1 mol/L HCl 1 mL使其分散，以12 000 r/min離心20 min，取上層清液。使用紫外分光光度計測量上清液在480 nm處的值，然后基于標準曲線計算游離黃芩苷的量，從而獲得負載在納米凝膠上黃芩苷的量。

包封率＝(3－2)/3

載藥量＝(3－2)/1

3為總藥物的量，2為游離的藥物的量，1為載藥納米凝膠的總量

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和公式計算，載藥納米凝膠包封率為（95.00±2.54）%，載藥量（17.00±1.26）%。

2.6.4 黃芩苷及載藥納米凝膠的體外釋放 實驗研究結(jié)果顯示，黃芩苷在pH 7.4的PBS緩沖液中的平衡溶解度可達到6.7 mg/mL，故選其作為釋放介質(zhì)。分別稱取適量的黃芩苷和BA-LZM-LMWC- NGs置于透析袋，置于500 mL pH值為7.4的PBS中，在（37.0±0.5）℃的恒溫水浴振蕩器中持續(xù)攪拌（100 r/min）。分別在0、0.2、0.5、1、2、4、8、12、24 h取樣5 mL，立即用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液4 mL待測，同時補充相同溫度下保存的新鮮釋放介質(zhì)5 mL。在278 nm波長下采用紫外分光光度計分析檢測續(xù)濾液中黃芩苷含量，計算黃芩苷的累積釋放率（）。

設(shè)置3個平行實驗，藥物釋放率通過公式計算得到。如圖11所示，隨著時間的延長，黃芩苷和BA- LZM-LMWC-NGs的累積釋放率均逐漸增加。在24 h內(nèi)，黃芩苷釋放了98%，黃芩苷從BA-LZM- LMWC-NGs中72 h內(nèi)釋放了72%，這一結(jié)果表明BA-LZM-LMWC-NGs中黃芩苷的釋放有一定緩釋效果。

0和分別表示釋放液體積和每次取樣體積，表示第次取樣時黃芩苷的釋放質(zhì)量濃度，表示BA-LZM-LMWC- NGs的質(zhì)量，表示BA-LZM-LMWC-NGs的載藥量

圖11 黃芩苷及BA-LZM-LMWC-NGs的體外釋放曲線

Fig. 11 Baicalin and BA-LZM-LMWC-NGsin vitro release

3 討論

具有高功能的納米凝膠因其制造有低成本、低環(huán)境負荷、低能耗等特點，成為目前人們研究的熱點。目前已采用不同的材料，如高分子聚合物、脂質(zhì)體/脂質(zhì)、金屬/金以及蛋白質(zhì)等制成不同類型的納米載藥體系，以提高灌注治療效果，并降低藥物的毒副作用。蛋白質(zhì)和多糖作為天然、無毒、可降解的天然高分子，更受研究者的青睞[14]。兩親性高分子衍生物，如殼聚糖、羧甲基纖維素等，既可通過電荷與蛋白質(zhì)質(zhì)肽類藥物相互作用，又可通過其疏水基團與蛋白質(zhì)質(zhì)肽類藥物的脂溶性基團相互作用，雙重作用更有利于納米載體對蛋白質(zhì)質(zhì)肽類藥物的負載[15-17]。

基于上述研究結(jié)論，本實驗用Maillard反應(yīng)和球狀蛋白質(zhì)加熱?；碚?，以溶菌酶和殼聚糖為原料，得到粒徑范圍為16～120 nm，平均粒徑為49.02 nm，PDI為0.132的LZM-LMWC納米凝膠粒。利用TNBS法通過測定溶菌酶糖基化反應(yīng)前、后自由氨基的含量，推算出LZM-LMWC的接枝率為（24.7±2.9）%。通過紫外分光光度計測定分析了LZM-LMWC納米凝膠的載藥量和包封率及BA- LZM-LMWC-NGs體外釋放率，并通過對比發(fā)現(xiàn)LZM-LMWC納米凝膠對黃芩苷的釋放可產(chǎn)生緩釋效應(yīng)，增加藥物的生物利用度。LZM-LMWC納米凝膠粒物理性能穩(wěn)定，大小分布均勻，為進一步在體實驗提供了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and characterization of lysozyme-low molecular weight chitosan loaded with baicalin

JIANG Yu-qin1, LU Xun2, SUN Xiao-yi1, TANG Yu-yan1, LIU He-jing1, LIU Yang3, WEI Ming-gang1

1. The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, China 2. Suzhou Municipal Hospital, Suzhou 215000, China 3. College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China

Based on the preparation technology of protein polysaccharide nanomaterials, through the modification of low molecular weight chitosan to lysozyme and the adjustment of environmental factors, by controlling the self-assembly behavior of lysozyme, to prepare a green environment-friendly lysozyme low molecular weight chitosan nanomer gel with core shell structure, thereby reducing gel size, increasing entrapment efficiency and drug loading, and making it more conducive to renal target.Lysozyme and low molecular weight chitosan were synthesized by Maillard reaction and SDS-PAGE was used to optimize the ratio of lysozyme and low molecular weight chitosan with the highest yield; The synthesized products were characterized by endogenous fluorescence and UV detection, and the grafting rate was determined by TNBS method; The particle size was used as the evaluation index, The optimal conditions for the preparation of the blank nanomaterials were screened and optimized by optimizing the conditions of lysozyme concentration, reaction system pH and heating temperature. With the entrapment efficiency, the suitable drug loading methods were selected to obtain the nanogel loaded with baicalin.The content of lysozyme low molecular weight chitosan with a graft ratio of (24.7 ± 2.9)% was obtained, and the blank nanogel with a particle size of 16—120 nm, an average particle size of 49.02 nm and a PDI 0.132, and a baicalin nanogel with a entrapment efficiency of (95.00 ± 2.54)% and a drug loading of (17.00 ± 1.26)% were obtained.Lysozyme low molecular weight chitosan nanoscale gel by Maillard The optimal ratio of lysozyme to low molecular weight chitosan was synthesized by Maillard reaction and the best synthetic process was found. The prepared nano gel has high encapsulation efficiency, small particle size, uniform distribution and obvious sustained release effect.

lysozyme; low molecular weight chitosan; baicalin; Maillard reaction; self-assembled nanogels; kidney targeting; SDS- PAGE

R283.6

A

0253 - 2670(2021)13 - 3831 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.007

2020-11-11

國家自然科學基金面上項目（81673896）；蘇州市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（SYSD2019205）；蘇州市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（SYSD2019210）；蘇州市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（SYS2020119）

姜玉勤（1991—），女，碩士研究生，研究方向為中西結(jié)合腎臟病基礎(chǔ)與臨床。Tel: 13675517401 E-mail: 1113899366@qq.com

魏明剛（1975—），男，博士，主任中醫(yī)師，博士生導師，研究方向為中西結(jié)合腎臟病基礎(chǔ)與臨床。Tel: 13812791993 E-mail: weiminggang@suda.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]