電針對(duì)腦缺血大鼠突觸可塑性及小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響

徐 瓊劉建浩王天磊譚春鳳

(三亞市中醫(yī)院針灸科,海南三亞 572000)

隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程,腦血管疾病發(fā)病率呈逐年攀升態(tài)勢(shì),其中缺血性腦血管疾病發(fā)病率約占75%[1]。 針灸是治療腦血管疾病的有效手段,可體現(xiàn)中藥的優(yōu)勢(shì)和特色,其療效得到臨床認(rèn)可,研究發(fā)現(xiàn),針刺神庭、百會(huì)兩穴后可改善缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能、改善記憶和學(xué)習(xí)能力[2-3]。 突觸可塑性指大腦神經(jīng)元損傷后,突觸功能和形態(tài)上的改變,是腦神經(jīng)元可塑性的基礎(chǔ)[4]。 在正常生理?xiàng)l件下,小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2 亞型極化維持動(dòng)態(tài)平衡,以維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)正常功能,但受外界刺激后,小膠質(zhì)細(xì)胞偏向 M1 型極化,從而促進(jìn) TNF-α、IL-1β 表達(dá),加重中樞神經(jīng)損傷[5]。 隨著miRNA 的研究,研究發(fā)現(xiàn)電針能夠激活miR-21 的表達(dá)并影響腦缺血損傷[6],電針調(diào)控miR-21 可能是其機(jī)制之一。 轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)通路是腦缺血引起損傷的重要途徑,在腦缺血模型大鼠腦組織中被激活,抑制STAT3 活性可緩解大鼠腦損傷癥狀[7],且電針能影響STAT3 的表達(dá)。 因此本研究構(gòu)建局灶性腦缺血大鼠模型,觀察電針對(duì)大鼠突觸可塑性、小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,并探討影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 128 只大鼠均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2018-0034],在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)[SYXK(粵)2018-0001],均7 周齡,體重220 ~250 g,于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),自由飲食飲水,光照周期為12 h,本研究經(jīng)三亞市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SYLL-2017-12),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

miR-21 和內(nèi)參U6 引物(蘇州泓迅生物科技股份有限公司);尼莫地平片(天津市中央藥業(yè)有限公司,規(guī)格:每片20 mg,國(guó)藥準(zhǔn)字 119004);兔抗鼠STAT3、兔抗鼠 p-STAT3、兔抗鼠 JAK2、兔抗鼠 p-JAK2、兔抗鼠內(nèi)參 β-Actin、羊抗兔 IgG-HRP 二抗(上海恒斐生物科技有限公司, 貨號(hào)分別為K002382P、 bs-3429R-1、 K001746P、 K006248P、K006153P、SE134);Dylight 405 標(biāo)記山羊抗兔 IgG(H+L)(北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào)為YT868);G-6805 型電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司);無(wú)菌針灸針(0.3 mm×25 mm)(蘇州華佗蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司);HM525 型冷凍切片機(jī)(德國(guó)MICROM 公司);ZF-388 型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(深圳三利化學(xué)品有限公司);BSF-30 型熒光顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型構(gòu)建

采用大腦中動(dòng)脈阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)構(gòu)建大腦中動(dòng)脈致局灶性腦缺血模型[8],大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,右側(cè)臥位固定,用消毒后的手術(shù)剪沿大鼠耳眼連線中點(diǎn)剪開(kāi)皮膚,分離右側(cè)頸動(dòng)脈、迷走神經(jīng)、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端用細(xì)線雙重結(jié)扎離斷,并在舌和上頜動(dòng)脈分支近端切斷,小切口縫合線插入頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈殘端。 通過(guò)激光多普勒血流計(jì)監(jiān)控腦血流,當(dāng)出現(xiàn)至少70%腦血流減少時(shí)納入研究對(duì)象,閉塞60 min 建立局灶性腦缺血模型,假手術(shù)組只暴露大腦中動(dòng)脈,不行凝閉。 分別模型建立后和治療3 周結(jié)束后參照Longa 評(píng)分[9]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)大鼠情況:手提大鼠尾巴懸空,無(wú)神經(jīng)功能損傷,兩前肢向地面伸直(0 分);輕微神經(jīng)功能缺損,病灶對(duì)側(cè)前肢肘曲,抬高,肘關(guān)節(jié)伸直,肩內(nèi)斂(1 分);中度局灶性神經(jīng)功能缺損,伴有癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)現(xiàn)象(2 分);重度局灶性神經(jīng)功能缺損,伴有向病灶對(duì)側(cè)跌倒現(xiàn)象(3 分);無(wú)自發(fā)活動(dòng)和認(rèn)知水平下降(4 分)。 剔除無(wú)癥狀(0 分)或癥狀過(guò)重(4 分)大鼠,1~3 分說(shuō)明模型構(gòu)建成功。 0 分說(shuō)明假手術(shù)組大鼠構(gòu)建成功。

1.3.2 分組及治療方法

模型制備成功大鼠分為模型組、電針組、尼莫地平組,每組32 只,假手術(shù)組32 只。 模型建立后2 h 電針組選取神庭、百會(huì)兩穴,用0.3 mm×25 mm 的1 寸毫針直刺神庭穴0.5 寸,斜刺百會(huì)穴0.5 寸,以5~10 次/s,強(qiáng)度 3~5 V 的疏密波,時(shí)間 30 min 行電針治療,每天一次;尼莫地平組每天灌胃給藥一次(20 mg/kg,2 mL)[10];假手術(shù)組、模型組灌胃給藥等體積的生理鹽水,連續(xù)治療3 周。

1.3.3 TTC 染色大鼠腦組織檢測(cè)大鼠梗死情況

治療3 周結(jié)束后,各組隨機(jī)選取8 只大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,手術(shù)開(kāi)胸,暴露心臟,用37℃生理鹽水灌注心臟,手術(shù)取經(jīng)上述操作大鼠腦組織,置于-20℃冰箱中冷凍0.5 h 后取出,切片(2 mm),避光條件下置于37 ℃ 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)中染色0.5 h。 可見(jiàn)染色后腦未梗死區(qū)域呈紅色,梗死區(qū)域呈白色,用Image Pro Plus 軟件計(jì)算每個(gè)腦組織的梗死體積。

1.3.4 透射電鏡觀察腦皮層區(qū)突觸超微并對(duì)形態(tài)學(xué)計(jì)量

治療結(jié)束后,各組隨機(jī)選取8 只大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,立刻手術(shù)開(kāi)胸,暴露心臟,行左心室主動(dòng)脈插管,灌入100 mL 37℃生理鹽水,隨后用PBS(含有2.5%戊二醛和4%多聚甲醛)灌流0.5 h。 手術(shù)取經(jīng)上述操作大鼠左側(cè)缺血腦皮層(見(jiàn)圖1),部分腦皮層放入PBS(含有2%戊二醛和2%多聚甲醛)溶液中固定3 h,固定結(jié)束后用PBS 清洗3 次,4℃條件下用1%鋨酸固定1 h,PBS 清洗3 次,梯度乙醇洗脫,丙酮脫水,在含有丙酮的包埋液中滲透2 h,純Epon812 包埋液中滲透3 h,滲透結(jié)束后置于60℃烘箱中過(guò)夜,超薄切片(約60 nm),將切片至于銅網(wǎng)上(300 目),經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸鈾染色,電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)并根據(jù)Bertoni-Freddari 等[11]方格點(diǎn)計(jì)數(shù)法定量分析面數(shù)密度(Nv)、突觸體密度(Vv)、突觸連接帶面密度(Sv)、突觸后致密物質(zhì)(PSD),用生物圖像分析儀定量分析突觸間隙寬度和突觸界面曲面率。

圖1 大鼠腦皮層Figure 1 Cerebral cortex of rats

1.3.5 免疫熒光檢測(cè)腦皮層區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況

部分腦皮層隨后將切片平鋪至多聚賴氨酸處理后的載玻片上,PBS 清洗3 次,60℃烘箱烤片0.5 h,PBS 清洗3 次,室溫下在3 %過(guò)氧化氫溶液中孵育10 min,轉(zhuǎn)移至5%胎牛血清的濕盒中孵育0.5 h,孵育結(jié)束后加入兔抗鼠 Iba1、iNOS、Arg1 一抗(1 ∶200),4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜,滴加Dylight 405 標(biāo)記山羊抗兔 IgG(H+L)(1 ∶200),37℃ 孵育 2 h,使用DAPI 染核,封片,熒光顯微鏡拍照,使用Image J 軟件計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 qRT-PCR 法檢測(cè)腦皮層區(qū)miR-21 水平

治療結(jié)束后,剩余8 只大鼠脫頸處死,立刻手術(shù)取出腦皮層,取部分TRIzol 法提總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 用qRTPCR 儀測(cè)定 miR-21 水平,miR-21 上游引物:5’-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3’;下游引物:5’-CCTCCACAAAGAGCCACC-3’。 內(nèi)參 U6 上游引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’; 下 游 引物:5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。 反應(yīng)體系(20 μL):上下游引物各 0.5 μL,2×Mix 10 μL,cDNA 模板 1 μL,H2O 8 μL。 反應(yīng)條件設(shè)定為:95℃預(yù)變性5 min,95℃ 10 s、62℃ 30 s,78℃ 30 s,45個(gè)循環(huán),72℃延伸 5 min。 2-ΔΔCT法對(duì)各組 miR-21 水平定量分析。

1.3.7 蛋白印跡法測(cè)定腦皮層區(qū)JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白水平

部分腦皮層區(qū)置于含200 μL 蛋白裂解液的研缽中,充分研磨,離心取上清液,根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白含量,上樣行SDS-PAGE 電泳(濃縮膠 80 V、30 min,分離膠 120 V、60 min 電泳),濕法轉(zhuǎn)膜,室溫下5% BSA 封閉位點(diǎn)1 h,分別加入兔抗鼠JAK2、兔抗鼠 p-JAK2、兔抗鼠 STAT3、兔抗鼠p-STAT3、兔抗鼠內(nèi)參 β-Actin 抗體(1 ∶1000),4 ℃孵育過(guò)夜,加入羊抗兔IgG-HRP 二抗(1 ∶1000),37℃條件下孵育1 h 后,ECL 顯影、曝光、凝膠成像儀拍照觀察并根據(jù)灰度值分析蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()形式表示,多組比較行單因素方差分析,任意兩組相比行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療后神經(jīng)功能缺損評(píng)分

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,電針組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低(P<0.05);電針組與尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療后神經(jīng)功能缺損評(píng)分(, n=32)Table 1 Score of nerve function defect after treatment in each group

表1 各組大鼠治療后神經(jīng)功能缺損評(píng)分(, n=32)Table 1 Score of nerve function defect after treatment in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

組別Groups神經(jīng)功能缺損評(píng)分Neurological deficit score假手術(shù)組Sham operation group 0.00±0.00模型組Model group 2.35±0.13a電針組Electroacupuncture group 1.72±0.10ab尼莫地平組Nimodipine group 1.73±0.11ab

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦梗死體積顯著升高(P<0.05);與模型組相比,電針組和尼莫地平組大鼠腦梗死體積明顯降低(P<0.05);電針組與尼莫地平組大鼠腦梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)圖 2 和表 2。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較( ,n=8)Table 2 Comparison of cerebral infarction volume of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死體積比較( ,n=8)Table 2 Comparison of cerebral infarction volume of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

組別Groups腦梗死體積(mm3)Cerebral infarction volume假手術(shù)組Sham operation group 0.00±0.00模型組Model group 65.19±6.83a電針組Electroacupuncture group 20.15±3.17ab尼莫地平組Nimodipine group 19.74±3.91ab

圖2 各組大鼠腦梗死情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Figure 2 Cerebral infarction of rats in each group

2.3 各組大鼠腦皮層區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)觀察和形態(tài)學(xué)計(jì)量分析

模型組突觸數(shù)目明顯減少,神經(jīng)突起中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)散亂,突觸間隙變窄,連接帶變短,伴有巨大空泡樣,軸漿漲大;電針組可見(jiàn)突觸數(shù)量增多,神經(jīng)突起中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)清晰,突觸間隙變寬,連接帶變長(zhǎng),伴有少量空泡樣;尼莫地平組突觸超微結(jié)構(gòu)與電針組類(lèi)似,見(jiàn)圖3。 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠突觸 Nv、Vv、Sv、PSD、突觸界面曲面率、突觸間隙寬度明顯降低(P<0.05);與模型組相比,電針組、尼莫地平組大鼠突觸 Nv、Vv、Sv、PSD、突觸界面曲面率、突觸間隙寬度顯著升高(P<0.05);電針組與尼莫地平組大鼠突觸 Nv、Vv、Sv、PSD、突觸界面曲面率、突觸間隙寬度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖 3 和表3。

表3 各組大鼠突觸形態(tài)學(xué)計(jì)量分析( ,n=8)Table 3 Morphological and quantitative analysis of synapses in rats of each group

表3 各組大鼠突觸形態(tài)學(xué)計(jì)量分析( ,n=8)Table 3 Morphological and quantitative analysis of synapses in rats of each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

組別Groups面數(shù)密度Nv(piece/μm3)突觸體密度Vv(μm2/μm3)突觸連接帶面密度Sv(μm2/μm3)突觸后致密物質(zhì)PSD(nm)突觸界面曲面率Surface rate of synaptic interface突觸間隙寬度(nm)Width of synaptic space假手術(shù)組Sham operation group 2.15±0.18 0.12±0.03 0.14±0.02 49.57±3.06 1.25±0.06 25.78±1.29模型組Model group 0.48±0.06a 0.04±0.01a 0.04±0.02a 32.18±2.29a 1.06±0.04a 13.57±1.18a電針組Electroacupuncture group 1.29±0.14ab 0.08±0.02ab 0.07±0.03ab 39.01±3.18ab 1.12±0.03ab 18.70±1.24ab尼莫地平組Nimodipine group 1.26±0.15ab 0.08±0.03ab 0.07±0.02ab 40.02±3.37ab 1.13±0.05ab 17.69±1.36ab

圖3 各組大鼠腦皮層區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Figure 3 Synaptic ultrastructure of cerebral cortex of rats in each group

2.4 各組大鼠腦皮層區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦皮層M1 小膠質(zhì)細(xì)胞(iNOS)數(shù)量顯著升高(P<0.05),M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞(Arg1)數(shù)量明顯降低(P<0.05);與模型組相比,電針組和尼莫地平組M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05),M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05);電針組與尼莫地平組M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞和M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖 4 和表 4。

圖4 各組大鼠腦皮層區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Arrows indicate positive cells.Figure 4 Number of microglias in the cortex of rats in each group

表4 各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)( ,n=8)Table 4 Number of microglias in each rat group

表4 各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)( ,n=8)Table 4 Number of microglias in each rat group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham operation group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

組別Groups M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞(個(gè)/視野)M1 type small keratinocytes(piece/field of vision)M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞(個(gè)/視野)M2 type small keratinocytes(piece/field of vision)假手術(shù)組 Sham operation group 52.74±7.28 150.46±15.73 12.06±2.71a電針組 Electroacupuncture group 22.29±5.14ab 50.84±6.22ab尼莫地平組Nimodipine group 18.25±7.10ab 51.49±7.53ab模型組Model group 98.48±10.76a

2.5 各組大鼠腦皮層區(qū) miR-21、 STAT3、 p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平

各組大鼠腦皮層區(qū)STAT3、JAK2 水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦皮層區(qū) miR-21、p-STAT3、p-JAK2 水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,電針組和尼莫地平組大鼠腦皮層區(qū) miR-21、p-STAT3、p-JAK2 水平明顯降低(P<0.05);電針組與尼莫地平組大鼠腦皮層區(qū)miR-21、p-STAT3、p-JAK2 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)圖 5 和表 5。

圖5 各組大鼠腦皮層區(qū) STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Figure 5 STAT3, p-STAT3, JAK2 and p-Jak2 levels in the cerebral cortex of rats in each group

表5 各組大鼠腦皮層區(qū)miR-21、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平( ,n=8)Table 5 miR-21, STAT3, p-STAT3, JAK2, and p-JAK2 levels in the cerebral cortex of rats in each group

表5 各組大鼠腦皮層區(qū)miR-21、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平( ,n=8)Table 5 miR-21, STAT3, p-STAT3, JAK2, and p-JAK2 levels in the cerebral cortex of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

組別Groups miR-21/U6 p-STAT3/STAT3 p-JAK2/JAK2假手術(shù)組 Sham operation group 1.06±0.17 0.24±0.04 0.27±0.04模型組 Model group 2.46±0.25a 1.25±0.18a 1.30±0.14a電針組 Electroacupuncture group 1.71±0.19ab 0.81±0.09ab 0.76±0.09ab尼莫地平組 Nimodipine group 1.72±0.21ab 0.77±0.08ab 0.77±0.08ab

3 討論

腦缺血中醫(yī)論證與虛(氣虛、陰虛)、風(fēng)(外風(fēng)、肝風(fēng))、氣(氣逆)、火(心火、肝火)、血(血瘀)、痰(濕痰、風(fēng)痰)六端相關(guān)[12]。 針灸作為腦缺血的治療手段,神庭位于人中心之處,神庭“神處其中則靈,靈則應(yīng),應(yīng)則保身”,可調(diào)控人神經(jīng)系統(tǒng)[13]。 百會(huì)為百脈之宗,各經(jīng)脈之氣匯聚之地,可貫達(dá)全身,連貫全身周穴,調(diào)控機(jī)體陰陽(yáng)平衡[14]。 本研究為選擇神庭、百會(huì)穴行電針治療,探究電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠的影響,MCAO 法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈致局灶性腦缺血模型,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積顯著升高,提示模型構(gòu)建后神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重。 與模型組相比,經(jīng)電針后,大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積明顯降低,說(shuō)明電針能夠緩解局灶性腦缺血大鼠腦損傷,具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為自組織、信息處理、行為適應(yīng)的復(fù)雜系統(tǒng)由大量的神經(jīng)元組成,正常情況下神經(jīng)元的興奮性和抑制性突觸可塑性處于平衡狀態(tài),維持大腦信息生成和傳遞效率,但在腦缺血后出現(xiàn)興奮性氨基酸毒性作用,導(dǎo)致突觸可塑性發(fā)生改變[15-16]。 本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織突觸數(shù)目明顯減少、間隙變窄、連接帶變短,神經(jīng)突起中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)散亂,伴有巨大空泡樣,軸漿漲大,Nv、Vv、Sv、PSD、突觸界面曲面率、突觸間隙寬度明顯降低,說(shuō)明模型組大鼠突觸形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變。 經(jīng)電針治療后,大鼠腦組織突觸數(shù)量增多、間隙變寬、連接帶變長(zhǎng),神經(jīng)突起中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)清晰,突觸 Nv、Vv、Sv、PSD、突觸界面曲面率、突觸間隙寬度顯著升高,說(shuō)明電針治療可保護(hù)突觸可塑性,恢復(fù)突觸界面曲面率,可能對(duì)于自組織、信息處理、行為適應(yīng)有緩解作用。 小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于促進(jìn)突觸發(fā)育、維持突觸正常功能和突觸可塑性具有調(diào)節(jié)作用,腦缺血后會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)極化,小膠質(zhì)與神經(jīng)元接觸時(shí)間延長(zhǎng),導(dǎo)致部分突觸結(jié)構(gòu)消失,缺血早期梗死區(qū)向M2 型極化;隨著病情的嚴(yán)重向M1 型極化,而M1 型主導(dǎo)炎癥反應(yīng),從而過(guò)表達(dá)CD86、MHCⅡ、iNOS、Fcγ 受體,可分泌炎性介質(zhì)以加重中樞神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腦組織受損[17]。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組大鼠海馬區(qū)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著升高,M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯降低,提示該研究中腦缺血已處于嚴(yán)重時(shí)期,小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型極化嚴(yán)重,而M1 型主導(dǎo)炎癥反應(yīng),加重腦損傷。 經(jīng)治療后小膠質(zhì)細(xì)胞可向M2亞型極化,從而過(guò)表達(dá)CD206、Arg1 以分泌保護(hù)因子清除參與中樞神經(jīng)免疫、修復(fù),同時(shí)可清除中樞代謝廢物,實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)的保護(hù)[18]。 本研究同樣證明,經(jīng)電針治療后,大鼠M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯降低,M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著升高,說(shuō)明電針可改善小膠質(zhì)細(xì)胞極化失衡,恢復(fù)神經(jīng)功能。 但是電針通過(guò)何種信號(hào)通路以保護(hù)突觸可塑性和維維持膠質(zhì)細(xì)胞極化平衡有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,miR-21 水平和STAT3、JAK2 磷酸化水平顯著升高,說(shuō)明腦缺血大鼠腦皮層區(qū)miR-21/JAK2/STAT3 通路被激活。 在腦缺血大鼠腦皮層區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)高度活化可誘導(dǎo)JAK2 磷酸化,從而促使STAT3 磷酸化參與調(diào)節(jié)破壞突觸可塑性[19]。 miR-21 可能調(diào)控多基因、多環(huán)路表達(dá)紊亂,可影響一系列調(diào)控失常的精神分裂結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò),STAT3 可參與神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng),以加重中樞神經(jīng)損傷;miR-21 其中通過(guò)別的通路調(diào)控STAT3 信號(hào)通路在精神分裂癥大鼠腦組織中處于激活狀態(tài)影響疾病[20]。 經(jīng)電針治療后,大鼠腦皮層區(qū) miR-21 水平和 STAT3、JAK2 磷酸化水平明顯降低,說(shuō)明電針可抑制miR-21/JAK2/STAT3 通路活性。

綜上所述,局灶性腦缺血大鼠行神庭、百會(huì)穴電針治療可保護(hù)突觸可塑性和維持膠質(zhì)細(xì)胞極化平衡,可能與抑制miR-21/JAK2/STAT3 通路活性相關(guān)。 但是具體調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。