基于數(shù)據(jù)庫(kù)分析HRH3 在肝癌中的功能作用及臨床意義

胡艷芬張文桃朱劍軍吳 昊劉 銘

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室,太原 030001)

肝癌的發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第六位,死亡率位居第三位, 其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占肝癌的 75%~85%[1]。 每年全球新增肝癌病例約84 萬(wàn),新增死亡病例約78 萬(wàn)[1]。與HCC 發(fā)生相關(guān)的主要危險(xiǎn)因素包括:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV) 和丙型肝炎病毒(Hepatitis V virus, HCV)慢性感染、黃曲霉毒素、酒精過(guò)量攝入、肥胖、吸煙和2 型糖尿病。 由于多數(shù)患者在首診時(shí)已處于進(jìn)展期,導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后總體較差[1-3]。 已鑒定發(fā)現(xiàn) p53、TERT 啟動(dòng)子突變、Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體/Ras/MAPK 等與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。 但是,截至目前為止,肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚[1-2]。 因此,繼續(xù)尋找與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子靶標(biāo)具有重要的臨床意義。 組胺受體H3(histamine receptor H3,HRH3)是組胺的一種受體[7]。 組胺通過(guò)與其受體(HRH1,HRH2,HRH3,HRH4)結(jié)合發(fā)揮作用[8]。 人HRH3基因定位于第20 號(hào)染色體(20q13.33),GenBank 登錄號(hào)為NM_007232,編碼的蛋白由446 個(gè)氨基酸組成。 HRH3 是細(xì)胞膜整合蛋白,歸屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族,在調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面發(fā)揮重要作用[7]。 研究表明,在平滑肌細(xì)胞中,HRH3 能夠增強(qiáng)電壓依賴性的鈣離子電流[9]。 國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道HRH3 在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用,包括,膽管癌、胰腺癌、前列腺癌等[7-8,10-13]。 但是,截至目前為止,HRH3 在肝細(xì)胞癌的研究較少。 因此,本文基于 ULACAN、STRING、Kaplan-Meier Plotter 等公共數(shù)據(jù)庫(kù),全面分析HRH3 在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平和功能作用,初步探討HRH3 作為一種新的HCC患者早期篩查及預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值,為后續(xù)開展實(shí)驗(yàn)性研究及肝細(xì)胞癌早期診斷和預(yù)后判斷提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源和方法

利用ULACAN 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /ualcan.path.uab.edu/index.html)分析HRH3 在 HCC 中的表達(dá)水平[14]。 登錄 ULACAN 數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè),設(shè)定條件:1)TCGA Analysis;2)Scan by Gene(s):HRH3;3)TCGA Dataset: Liver hepatocellular carcinoma; 4) 點(diǎn)擊Explore;5)點(diǎn)擊Expression;6)HRH3 expression based on, 選擇 Sample types。 7) 點(diǎn)擊HRH3 expression based on 后方的二級(jí)菜單,分析HRH3 表達(dá)水平與HCC 患者臨床病理因素的關(guān)系。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和基因功能分析

基于 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:/ /string-db.org/cgi/input.pl?taskId)分析HRH3 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和基因功能分析。 登錄STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè),設(shè)定條件:1) Protein name; HRH3; 2) Organism: Homo sapiens;3)點(diǎn)擊Search;4)點(diǎn)擊系統(tǒng)默認(rèn)選項(xiàng);5)點(diǎn)擊Continue;6)完成蛋白互作網(wǎng)絡(luò);7)點(diǎn)擊Analysis;8)查看 Functional enrichment in your network, 下載Biological process (GO) 數(shù) 據(jù);9) 下 載 Molecular Function(GO) 數(shù)據(jù);10) 下載 Cellular Component(GO)數(shù)據(jù);11)下載KEGG Pathways 數(shù)據(jù);12)點(diǎn)擊Viewers,選擇Coexpression,點(diǎn)擊 Tables,下載 HRH3與其互作蛋白共表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3 生存預(yù)后分析

基于Kalpa-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /kmplot.com/analysis/)分析HRH3 與HCC 患者臨床生存預(yù)后的關(guān)系。 登錄 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè),選擇mRNA RNA-Seq,選擇Start KM Plotter for liver cancer, 設(shè)定條件:1)Gene symbol:HRH3;2)Split patients by:選擇 Auto select best cutoff;3)Survival:總生存期選擇OS;無(wú)復(fù)發(fā)生存期選擇RFS;4)其它選擇系統(tǒng)默認(rèn)條件;5)分析HRH3 生存預(yù)后與HCC 患者臨床病理因素的關(guān)系。 按照中位數(shù)法將肝癌樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HRH3 在肝癌組織中的表達(dá)水平

采用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù),分析HRH3 在371 例肝癌組織中的表達(dá)水平。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),HRH3 在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在正常肝組織中的表達(dá)水平(P<0.01)(圖1)。 進(jìn)一步研究分析,HRH3 在肝癌組織中的表達(dá)水平與患者性別無(wú)關(guān)(P=0.711)(圖 2A)。HRH3 在 41~60 歲年齡段患者肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于其在61~80 歲年齡段患者中的表達(dá)水平 (P=0.045)(圖2B)。 同時(shí),我們的研究結(jié)果顯示,HRH3 在肝癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53 基因突變等因素?zé)o關(guān)(均P>0.05)(圖2C~2F)。

圖1 HRH3 基因在肝癌組織中的表達(dá)水平Figure 1 Gene expression of HRH3 in HCC

圖2 HRH3 表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系Note. A, Gender. B, Age. C, Tumor stage. D, Tumor differentiation. E, Nodal metastasis. F, TP53 mutation. D, 1, Well differentiated. 2, Moderately differentiated. 3, Poorly differentiated. 4,Undifferentiated. E, N0, No regional nodal metastasis. N1, Metastases in 1 to 3 axillary lymph node.Figure 2 Relationship between the HRH3 expression and the clinicopathologic characteristics of HCC patients

2.2 生存分析結(jié)果

Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中HRH3 在肝細(xì)胞癌中的研究樣本為364 例。 結(jié)果顯示,和HRH3 高表達(dá)組相比,HRH3 低表達(dá)組的總生存期(overall survival, OS) 和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival, RFS)均顯著縮短(HRH3 低表達(dá)組的OS為33.5 月,HRH3 高表達(dá)組的 OS 為 82.9 月,P<0.05;HRH3 低表達(dá)組的 RFS 為 18.3 月,HRH3 高表達(dá)組的RFS 為48.43 月,P<0.01)(圖3)。

圖3 HRH3 在肝癌中的生存分析Figure 3 Survival analysis of HRH3 gene in HCC

此外,低表達(dá)HRH3 組早期患者(Ⅰ期和Ⅱ期)的OS 顯著低于高表達(dá)HRH3 早期患者。 但是,低表達(dá)HRH3 晚期患者(Ⅲ期和Ⅳ期)的OS 顯著高于高表達(dá)HRH3 晚期患者。HRH3 表達(dá)水平與無(wú)血管侵襲患者的生存預(yù)后相關(guān)(P<0.01),而HRH3 表達(dá)水平與已經(jīng)發(fā)生血管侵襲患者的生存預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.28)。HRH3 表達(dá)水平與男性患者的生存預(yù)后相關(guān)(P<0.01),而HRH3 表達(dá)水平與女性患者的生存預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.21)。

2.3 HRH3 基因 GO 分析和 KEGG 通路分析

HRH3 基因功能富集分析結(jié)果顯示,細(xì)胞組成方面主要與細(xì)胞膜、神經(jīng)元、質(zhì)膜的整體構(gòu)件、突觸及突觸前結(jié)構(gòu)等相關(guān);分子功能方面主要與G 蛋白偶聯(lián)的受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、胺受體活性、和G 蛋白偶聯(lián)的5-羥色胺受體活性等相關(guān);生物過(guò)程主要與G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑、抑制型腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)途徑、5-羥色胺受體信號(hào)途徑、和谷氨酸受體途徑等相關(guān)(圖4)。 信號(hào)通路富集結(jié)果顯示,HRH3 基因主要與5-羥色胺突觸傳遞、谷氨酸能突觸信號(hào)通路、味覺(jué)傳遞、酒精代謝等信號(hào)通路顯著相關(guān)(圖5)。

圖4 HRH3 基因的 GO 分析Figure 4 GO analysis of HRH3 gene

圖5 HRH3 基因的KEGG 通路分析Figure 5 KEGG pathway analysis of HRH3 gene

2.4 基于STRING 構(gòu)建HRH3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)果如圖6 所示,HRH3 蛋白與5-羥色胺 1A 受 體 ( 5-hydroxytryptamine receptor 1A,HTR1A)、5-羥色胺 1E 受體(5-hydroxytryptamine receptor 1E, HTR1E)、 5-羥 色 胺 5A 受 體 (5-hydroxytryptamine receptor.5A,HTR5A)、代謝型谷氨酸受體3(metabotropic glutamate receptor 3,GRM3)、代謝型谷氨酸受體4(metabotropic glutamate receptor 4,GRM4)、代謝型谷氨酸受體 8 (metabotropic glutamate receptor 8,GRM8)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基γ-3(guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-3,GNG3)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基 γ-13(guanine nucleotide-binding protein G (I)/G (S)/G (O) subunit gamma-13,GNG13)、腦啡肽原(proenkephalin-B,PDYN)、黑色素富集激素受體2(melanin-concentrating hormone receptor 2,MCHR2)有相互作用。

圖6 HRH3 基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 Protein interaction network diagram of HRH3 gene

2.5 基于STRING 分析HRH3 與其互作蛋白共表達(dá)相關(guān)性

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),分析HRH3 與其互作蛋白的表達(dá)相關(guān)性。 結(jié)果如圖7 所示,HRH3 蛋白與5-羥色胺受體家族成員有較好的相關(guān)性。 HRH3 表達(dá)水平與HTR5A 表達(dá)水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)是0.476;HRH3 表達(dá)水平與HTR1A 表達(dá)水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)是0.362;HRH3 表達(dá)水平與HTR1E 表達(dá)水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)是0.335。

圖7 HRH3 與相關(guān)分子的共表達(dá)分析Figure 7 Co-expression analyses for HRH3 and its interacted proteins

3 討論

原發(fā)性肝癌發(fā)病率位居全球所有惡性腫瘤第6位,死亡率高居第2 位,嚴(yán)重威脅人民的生命和健康[1-2]。 原發(fā)性肝癌主要包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌(HCC-ICC)3 種不同病理學(xué)類型,其中 HCC 占75%~85%[1]。 近年來(lái),研究報(bào)道HRH3 在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平異常,包括HCC,膽管癌,黑色素瘤、胰腺癌,乳腺癌等[8,10,13]。 Yu 等[8]報(bào)道HRH3在HCC 中呈顯著高表達(dá)。 Zhang 等[15]研究結(jié)果也表明HRH3 在HCC 中顯著高表達(dá),提示HRH3 可能與 HCC 發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 Francis 等[11]報(bào)道HRH3 在膽管癌組織和細(xì)胞中呈顯著高表達(dá)。 Chen 等[10]在前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)HRH3 呈顯著高表達(dá)。 與上述研究結(jié)果相似,本研究利用TCGA 公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析HRH3 在肝癌中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比,HRH3 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平顯著升高。 以上研究均表明,HRH3 在肝癌組織中呈高表達(dá),其可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞癌患者中HRH3 表達(dá)水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53 基因突變等因素?zé)o關(guān)。 Zhang 等[15]報(bào)道,HRH3 在低分化肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在高-中分化肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平,提示HRH3 與肝細(xì)胞癌的分化有關(guān)。 Chen 等[10]報(bào)道,HRH3 表達(dá)水平與前列腺癌的Gleason 評(píng)分相關(guān)。 我們推測(cè)上述研究結(jié)果的不一致,可能與腫瘤類型和入組標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。 本研究系統(tǒng)分析了HRH3 在371 例肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平與其臨床病理因素的關(guān)系,入組患者較以往研究多,結(jié)果相對(duì)可靠。

基因功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞組成方面,HRH3 及其相互作用蛋白主要分布于細(xì)胞膜、神經(jīng)元、和突觸等;分子功能方面主要與G 蛋白偶聯(lián)受體的活性有關(guān),包括5-羥色胺受體活性等;生物過(guò)程主要與G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),包括:抑制型腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)途徑、5-羥色胺受體信號(hào)途徑、谷氨酸受體途徑等相關(guān)。 KEGG 信號(hào)通路富集結(jié)果顯示,HRH3 基因主要與5-羥色胺信號(hào)傳遞、谷氨酸信號(hào)通路、酒精代謝等信號(hào)通路相關(guān)。環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)是細(xì)胞內(nèi)重要的信使分子[16]。 腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)在G 蛋白激活后,催化ATP 脫去焦磷酸形成cAMP[16]。 與我們的分析結(jié)果一致,Zhang 等[15]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HepG2 細(xì)胞敲除HRH3 后,細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平升高;在PLC/PRF/5 細(xì)胞過(guò)表達(dá)HRH3后,細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平降低,提示HRH3 參與調(diào)控肝癌細(xì)胞 cAMP 生成。 然而,HRH3 是否參與5-羥色胺受體信號(hào)途徑、谷氨酸受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、和酒精代謝,這有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

基于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),本研究發(fā)現(xiàn),HRH3 蛋白與5-羥色胺受體、代謝型谷氨酸受體等有緊密相互作用。 相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),HRH3 與5-羥色胺受體家族成員有較好的相關(guān)性。 5-羥色胺受體有十三種亞型,大多數(shù)歸屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族[17]。 研究報(bào)道,5-羥色胺受體表達(dá)異常,導(dǎo)致5-HT 代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)異常與多種消化道惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展緊密相關(guān),包括結(jié)直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌等[17-19]。Abdel-Razik 等[18]報(bào)道5-羥色胺是一種可能與HCC發(fā)生相關(guān)的生物胺。 5-羥色胺可與PIVKA-II 聯(lián)合用于慢性丙型肝炎-肝硬化患者早期HCC 的篩選,具有很好的臨床應(yīng)用前景。 本研究發(fā)現(xiàn)5-HTR1A,5-HRT1E 和5-HTR5A 與 HRH3 有緊密相互作用。5-HTR1A,5-HRT1E 和 5-HTR5A 均歸屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族,為Gi/o 蛋白,與腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián),可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度[20]。 以上研究提示,HRH3可能與5-羥色胺受體存在相互作用,其通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)cAMP 生成,在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

以往有研究報(bào)道HRH3 在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮雙重作用。 例如,Tanaka 等[21]研究報(bào)道雄性 ICR 小鼠喂食含有 HRH3 抑制劑Clobenpropit 的食物能夠顯著降低結(jié)腸腺癌的發(fā)病率,提示HRH3 發(fā)揮促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生的作用。 Lin等報(bào)道,抑制HRH3 能顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,提示HRH3 在惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌作用[13]。 然而,Francis 等[11]通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)HRH3 發(fā)揮抑制膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用,提示HRH3 發(fā)揮抑癌作用。 Davenas 等[22]研究結(jié)果表明,抑制 HRH3 活性后,鼠肝癌細(xì)胞McA-RH7777 的細(xì)胞增殖活性顯著降升高,提示HRH3 發(fā)揮抑癌作用。 我們的研究結(jié)果表明,在早期HCC 患者群體中,低表達(dá)HRH3 組的總生存期顯著低于高表達(dá)HRH3 組;而在晚期HCC 患者群體中,低表達(dá)HRH3 組的總生存期顯著高于高表達(dá)HRH3 組,提示HRH3 在肝細(xì)胞癌早期的發(fā)生過(guò)程中可能充當(dāng)抑癌基因的角色,抑制肝癌發(fā)生,而在肝細(xì)胞癌晚期的發(fā)展過(guò)程中可能充當(dāng)癌基因的角色,促進(jìn)肝癌進(jìn)展。 這一結(jié)果有待在更多的臨床標(biāo)本組織和公共數(shù)據(jù)集進(jìn)一步證實(shí)。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)HRH3 在HCC 中呈高表達(dá),其可能與5-羥色胺受體相互作用,調(diào)控胞內(nèi)cAMP生成,促進(jìn)肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。 此外,HRH3 高表達(dá)與早期 HCC 患者的良好預(yù)后相關(guān),而與晚期HCC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。 基于此,我們猜測(cè)HRH3 在HCC 早期發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用,而在HCC 晚期發(fā)展過(guò)程中充當(dāng)促癌作用。 因此,HRH3可能是HCC 診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的一個(gè)潛在腫瘤標(biāo)志物。