定量檢測(cè)PAX1 甲基化診斷宮頸癌前病變的應(yīng)用分析

卡米拉·庫(kù)來(lái)西江 朱敏 姜敏 馬玉花 梁飛 來(lái)依寧 高靜

宮頸癌屬于一種常見的女性生殖器官惡性腫瘤,近年來(lái)的發(fā)病率明顯提高,嚴(yán)重危害了女性身體健康［1］。宮頸癌形成的重要原因之一為HPV 反復(fù)、持續(xù)感染,相關(guān)研究顯示,PAX1 基因甲基化表達(dá)異常升高可在不同層次、階段對(duì)癌前病變病理進(jìn)程產(chǎn)生影響,和宮頸癌發(fā)生、發(fā)展存在密切相關(guān)性［2］。鑒于此,本研究分別對(duì)正常宮頸患者、低級(jí)別病變患者、高級(jí)別病變患者、癌變患者的宮頸刮片、組織標(biāo)本進(jìn)行收集,采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)PAX1 基因甲基化行定量檢測(cè),分析宮頸癌前病變?cè)\斷中PAX1 甲基化定量檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值,并將本院136 例高危亞型HPV 患者作為研究對(duì)象,以期能獲得理想的研究結(jié)果,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年12 月～2020 年4 月在本院診治的136 例高危型HPV 感染患者為研究對(duì)象,以病理結(jié)果為依據(jù)分為四組,即甲組(正常宮頸,28 例)、乙組(低級(jí)別病變,32 例)、丙組(高級(jí)別病變,33 例)、丁組(癌變,43 例)。甲組患者,年齡32～55 歲,平均年齡(40.12±5.25)歲；乙組患者,年齡31～54 歲,平均年齡(40.09±4.83)歲；丙組患者,年齡32～56 歲,平均年齡(40.28±5.31)歲；丁組患者,年齡32～54 歲,平均年齡(40.08±4.79)歲。四組患者的一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①患者知情同意；②精神、認(rèn)知功能正常；③經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①中途退出；②存在造血系統(tǒng)疾病；③存在免疫系統(tǒng)疾病；④妊娠者；⑤存在婦科良性或者惡性腫瘤病史。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集方法 指導(dǎo)所有患者取截石位,行常規(guī)消毒處理,獲取少量病變部位細(xì)胞之后,將其制作成為宮頸刮片,在陰道鏡下獲取宮頸組織行活檢,同時(shí)所有患者均接受HPV 檢查,獲取標(biāo)本后保存于4℃溫度下,待用。

1.3.2 DNA 提取、擴(kuò)增與修飾 采用Omniscript RT試劑盒(德國(guó)Qiagen 公司生產(chǎn))對(duì)DNA 進(jìn)行提取,并采用亞硫酸氫鹽進(jìn)行處理,然后再行PAX1 基因轉(zhuǎn)錄,基因外側(cè)下游、上游引物分別為：5'-ACCCA GCTCATCCACACTCCC-3'、5'-AAGTTGATTT AGGGTTTGGGGT-3'；PAX1基因下游、上游引物分別為：5'-AAATACCCRAGACTAAACGC-3'、5'-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3'。

1.3.3 基因測(cè)序 采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)行PAX1 基因甲基化定量檢測(cè),首先需合理配置混合液,包括熒光素酶14.6 mg/L、Klenow DNA 聚合酶18×10-3U/L、三磷酸腺苷雙磷酸酶2×10-3U/L、三磷酸腺苷硫酸化酶2×10-4U/L、D-蟲熒光素0.4 mmol/L、聚乙烯吡咯烷(PVP)0.4 μg/L、5’磷酸化硫酸腺苷(APS)3 μmol/L、二硫蘇糖醇(DTT)1 mmol/L、0.1%牛血清蛋白(BSA)、乙二胺四乙酸(EDTA)2 mmol/L、氨丁三醇(TAM)緩沖液0.1 mol/L。制作完成之后對(duì)樣本中PAX1 基因甲基化程度行定量測(cè)定,每份樣本甲基化程度為9 位點(diǎn)甲基化程度的平均值。

1.4 觀察指標(biāo) ①對(duì)比四組患者病變組織中的PAX1基因甲基化發(fā)生率、HPV 陽(yáng)性率；②對(duì)比四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平；③通過ROC 曲線分析PAX1 基因甲基化診斷高、低級(jí)別癌前病變、正常宮頸的有效性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組PAX1 基因甲基化發(fā)生率、HPV 陽(yáng)性率比較 甲組PAX1 基因甲基化患者0 例,發(fā)生率為0；乙組PAX1 基因甲基化患者2 例,發(fā)生率為6.25%；丙組PAX1 基因甲基化患者15 例,發(fā)生率為45.45%；丁組PAX1 基因甲基化患者43 例,發(fā)生率為100.00%。甲、乙、丙、丁四組患者的PAX1 基因甲基化發(fā)生率逐漸提高,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甲組HPV陽(yáng)性患者9 例,陽(yáng)性率為32.14%；乙組HPV 陽(yáng)性患者26 例,陽(yáng)性率為81.25%；丙組HPV 陽(yáng)性患者30 例,陽(yáng)性率為90.91%；丁組HPV 陽(yáng)性患者40 例,陽(yáng)性率為93.02%。甲、乙、丙、丁四組患者的HPV 陽(yáng)性率逐漸提高,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平比較 丁組患者宮頸組織、宮頸刮片中的PAX1基因甲基化水平均高于甲組、乙組、丙組,丙組高于甲組、乙組,乙組高于甲組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平比較(,%)

表1 四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平比較(,%)

注：與甲組比較,aP<0.05；與乙組比較,bP<0.05；與丙組比較,cP<0.05

2.3 ROC 曲線分析 通過繪制ROC 曲線得知,PAX1基因甲基化診斷高、低級(jí)別癌前病變、正常宮頸的ROC 曲線下面積為0.88,采用PAX1 基因甲基化水平診斷高級(jí)別宮頸癌前病變可知,最佳閾值為4.15%,此時(shí)特異度為79.15%,靈敏度為89.39%。見圖1。

圖1 ROC 曲線分析

3 討論

研究顯示,從宮頸癌前病變發(fā)展成為宮頸癌需要較長(zhǎng)時(shí)間,宮頸癌患者發(fā)病早期通常不會(huì)出現(xiàn)明顯臨床癥狀,等到有明顯臨床癥狀出現(xiàn)時(shí),通常已經(jīng)處于中晚期［3］。以往臨床多數(shù)研究顯示,宮頸癌前病變過程涉及多種基因改變,其中以DNA 甲基化為重要代表的表觀遺傳學(xué)改變尤為重要［4］。近年來(lái)的臨床研究顯示,PAX1 基因甲基化水平在宮頸癌組織中出現(xiàn)異常增高現(xiàn)象［5］。有學(xué)者針對(duì)我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)進(jìn)行分析,研究結(jié)果顯示宮頸癌患者PAX1 基因甲基化發(fā)生率高達(dá)89%,為此,臨床可嘗試將PAX1 基因甲基化水平作為早期診斷宮頸癌的一個(gè)重要標(biāo)志物［6］。但臨床多數(shù)研究均認(rèn)為,對(duì)PAX1 基因甲基化水平行定性分析難以量化判斷甲基化程度,只能用來(lái)診斷浸潤(rùn)癌。大部分宮頸癌出現(xiàn)的原因?yàn)镠PV 病毒反復(fù)、持續(xù)感染,因現(xiàn)階段臨床研究顯示低級(jí)別宮頸癌前病變發(fā)展為浸潤(rùn)癌的可能性較低,所以為了降低宮頸癌發(fā)生率,需對(duì)高級(jí)別宮頸癌前病變進(jìn)行及早篩查。

現(xiàn)階段,隨著細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)、HPV 病毒微量提取等各種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床,多數(shù)早期浸潤(rùn)性宮頸癌、宮頸癌前病變患者已經(jīng)獲得及時(shí)診治。研究顯示,HPV 感染最終并不一定會(huì)發(fā)展成為宮頸癌或者癌前病變,這也就說明可能有其他協(xié)同因子在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。臨床多數(shù)研究顯示,癌基因異常表達(dá)會(huì)對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生多方面影響,例如調(diào)控細(xì)胞分裂與細(xì)胞增殖過程等,同時(shí)抑癌基因異常甲基化也會(huì)對(duì)抑癌基因表達(dá)進(jìn)行抑制［7］。宮頸癌組織中PAX1 基因甲基化水平異常升高,并且可在宮頸癌脫落細(xì)胞中檢測(cè)到PAX1 基因甲基化。國(guó)外學(xué)者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)［8］,宮頸癌早期診斷過程中,可將PAX1 基因甲基化水平作為重要輔助診斷方式之一,該診斷方式區(qū)分正常組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)2 的特異度為92%,靈敏度為66%。雖然臨床關(guān)于宮頸癌患者PAX1基因甲基化水平的研究較多,但關(guān)于患病類型的鑒別區(qū)分卻較為少見。本研究采用定量分析方式對(duì)正常宮頸患者、低級(jí)別病變患者、高級(jí)別病變患者、癌變患者的PAX1 基因甲基化水平進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,甲組PAX1 基因甲基化發(fā)生率為0,乙組為6.25%,丙組為45.45%,丁組為100.00%,甲、乙、丙、丁四組患者的PAX1 基因甲基化發(fā)生率逐漸提高,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。丁組患者宮頸組織、宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平均高于甲組、乙組、丙組,丙組高于甲組、乙組,乙組高于甲組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示通過定量檢測(cè)PAX1 基因甲基化水平,可在一定程度上篩選宮頸癌高危人群,進(jìn)而為之后的隨訪觀察提供重要依據(jù)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)屬于新型DNA 序列分析方式之一,無(wú)需行熒光標(biāo)記與電泳,可對(duì)多個(gè)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),進(jìn)而獲取精準(zhǔn)的定量PAX1 基因甲基化測(cè)定值。該分析方式不僅可以用來(lái)定量檢測(cè)甲基化程度,同時(shí)還具備高準(zhǔn)確性與可重復(fù)性,相較于其他高通量測(cè)序技術(shù),該分析方式的檢測(cè)成本也相對(duì)更低。本研究通過繪制ROC 曲線得知,PAX1 基因甲基化診斷高、低級(jí)別癌前病變、正常宮頸的ROC 曲線下面積為0.88,同時(shí)經(jīng)初步研究分析得知,最佳閾值為4.15%時(shí),PAX1 基因甲基化水平診斷高級(jí)別宮頸癌前病變的特異度為79.15%,靈敏度為89.39%,提示臨床可將PAX1 基因甲基化水平作為早期宮頸癌診斷的重要輔助方式之一。

綜上所述,宮頸癌前病變?cè)\斷中PAX1 甲基化定量檢測(cè)具有一定應(yīng)用價(jià)值,可對(duì)高級(jí)別宮頸癌前病變進(jìn)行有效鑒別。