巨噬細(xì)胞的極化與脊髓膠質(zhì)瘢痕形成的一般規(guī)律研究

楊明坤，張旭，黨曉謙，吳登普，劉泯邑

(1.四川省巴中市中心醫(yī)院骨科，四川 巴中 636000；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科，陜西 西安 710000)

脊髓損傷是常見的疾病，尤其是完全性脊髓損傷，常出現(xiàn)多種并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致患者死亡[1]。截止目前，脊髓損傷的治療方法及效果仍然有限，究其原因是脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)軸突的修復(fù)，而脊髓膠質(zhì)瘢痕的形成是復(fù)雜的病理變化過程[2-4]。

炎癥反應(yīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后最為重要的病理過程之一。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中最為重要的炎癥細(xì)胞，具有加重炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織再生的雙重作用[5-7]。巨噬細(xì)胞之所以表現(xiàn)出這種雙重作用，與巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后表現(xiàn)為不同極化的亞型有關(guān)，目前已證實(shí)在脊髓損傷后巨噬細(xì)胞可極化為不同的亞型[8-10]。但是巨噬細(xì)胞的極化與膠質(zhì)瘢痕形成的關(guān)系規(guī)律未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過實(shí)驗(yàn)探討巨噬細(xì)胞與膠質(zhì)瘢痕形的一般規(guī)律，為后期通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化過程，促進(jìn)脊髓損傷治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及倫理學(xué)審查 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組；實(shí)驗(yàn)組分為脊髓損傷后1 d、7 d、14 d、28 d組，每組5只，對照組20只，共計(jì)40只。實(shí)驗(yàn)動物為SPF級雄性級小鼠(C57BL/6，鼠齡45～56 d)由三峽大學(xué)購進(jìn)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施前經(jīng)相關(guān)倫理委員會審查通過。

1.2 脊髓損傷模型的構(gòu)建 所購小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采取腹腔注射4%水合氯醛麻醉。手術(shù)區(qū)域脫毛后，皮膚消毒，采取縱行切口，切除T9～10棘突及椎板，暴露硬脊膜。實(shí)驗(yàn)組使用砸傷裝置將10 g重錘固定于5 cm高度，自由落下撞擊T9～10脊髓組織[11]。造模成果的標(biāo)志為：砸傷瞬間小鼠出現(xiàn)痙攣性擺尾及雙后肢回縮后癱瘓。對照組僅切除T9～10棘突及椎板，不損傷脊髓。所有小鼠術(shù)后給予保暖，麻醉蘇醒后移入動物房，正常喂養(yǎng)，術(shù)后前3天每日1次腹腔注射青霉素2萬單位，人工擠壓擠膀胱尿2次。實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)死亡小鼠及時再次造模補(bǔ)充。

1.3 膠質(zhì)瘢痕的觀察 分別于實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷后1 d、7 d、14 d、28 d取損傷區(qū)域脊髓標(biāo)本進(jìn)行如下檢測觀察膠質(zhì)瘢痕。(1)HE染色：將標(biāo)本經(jīng)75%、85%、90%、95%酒精及無水乙醇脫水后，再進(jìn)行透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟后染色，將切片入Mayer氏蘇木素染液染色5 min，自來水洗浸洗返藍(lán)。1%的鹽酸酒精染色2～5 s，入1%水溶性伊紅染液染色5 min，自來水洗浸洗30 s。風(fēng)干后中性樹膠封片，最后鏡檢。(2)免疫組化檢測：將標(biāo)本經(jīng)75%、85%、90%、95%酒精及無水乙醇脫水，再進(jìn)行透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟后，進(jìn)行抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、加酶標(biāo)二抗、加顯色劑、復(fù)染、脫水、封片等步驟后，將封好的切片平放于通風(fēng)櫥中晾干后進(jìn)行鏡檢。

1.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtimequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測巨噬細(xì)胞不同極化類型標(biāo)記物 RT-qPCR分別檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-a、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物Arginase-1、IL-10的表達(dá)量。Trizol試劑提取總RNA(美國賽默飛公司)，使用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR檢測指標(biāo)包括內(nèi)參(β-actin)、巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物(M1型標(biāo)記物IL-1β、TNF-α和M2型標(biāo)記物IL-10、Arginase-1的表達(dá)水平)，使用UltraSYBRRT-qPCR預(yù)混體系，反應(yīng)體系10 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s加60℃退火/延伸1 min。共35個循環(huán)。溶解曲線分析為95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s、60℃ 15 s。從ViiA7RT-qPCR系統(tǒng)自帶軟件中調(diào)取每個反應(yīng)管的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(CT值)，在Excel軟件上進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)相應(yīng)內(nèi)參(β-actin)的CT值求出各自△CT值，再根據(jù)對照組中假手術(shù)對照小鼠△CT值的均數(shù)求得各自△△CT值，最后求出2-△△CT數(shù)值用于被檢測基因相對表達(dá)量的比較。

1.5 ELISA檢測巨噬細(xì)胞不同極化類型標(biāo)記物 ELISA分別檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物TNF-a、IL-1β和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物Arginase-1、IL-10的表達(dá)量。(1)將待測標(biāo)本按說明書制備好以后，用封板膜封板后置37℃溫育30 min；(2)小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干；(3)每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外；(4)置37℃溫育30 min；(5)按上述步驟(2)重復(fù)一次；(6)每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；(7)每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；(8)于450 nm波長依序測量各孔的OD值。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)組造模過程中死亡小鼠1只，術(shù)后觀察階段死亡2只，死亡小鼠及時予以補(bǔ)充。對照組無死亡小鼠，補(bǔ)充小鼠重新計(jì)算實(shí)驗(yàn)時間。兩組小鼠術(shù)后均未出現(xiàn)感染。最終共有40只小鼠進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 膠質(zhì)瘢痕的觀察結(jié)果 (1)HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷1 d后出血均非常明顯，前角運(yùn)動神經(jīng)元腫脹，炎癥細(xì)胞聚集；損傷7～14 d時神經(jīng)元死亡較多，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，對照組未觀察到上述現(xiàn)象(見圖1)。(2)免疫組化染色后經(jīng)Image-proplus軟件分析，實(shí)驗(yàn)組中棕褐色細(xì)胞(炎癥細(xì)胞)數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的95.0%，對照組棕褐色細(xì)胞(炎癥細(xì)胞)數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)少于10%(見圖2)。

a 實(shí)驗(yàn)組1 d b 實(shí)驗(yàn)組7 d c 實(shí)驗(yàn)組14d e 實(shí)驗(yàn)組28 d f 對照組

a 實(shí)驗(yàn)組1 d b 實(shí)驗(yàn)組7 d c 實(shí)驗(yàn)組14 d e 實(shí)驗(yàn)組28 d f 對照組

2.3 RT-qPCR檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)果 經(jīng)IPP6.0軟件對免疫熒光照片進(jìn)行光密度分析，實(shí)驗(yàn)組M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物IL-1β、TNF-α在脊髓損傷后各時間點(diǎn)較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；脊髓損傷后第7天表達(dá)最高，隨后逐漸下降，至28 d趨于穩(wěn)定。對照組各時間點(diǎn)的IL-1β、TNF-a表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物IL-10、Arginase-1在脊髓損傷后各時間點(diǎn)較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；脊髓損傷后第14天表達(dá)最高，隨后逐漸下降，至28d趨于穩(wěn)定；對照組各時間點(diǎn)的IL-10、Arginase-1表達(dá)無明顯變化(P>0.05，見表1)。

表1 RT-qPCR檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)果

2.4 ELISA檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)果 ELISA檢測提示M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物IL-1β、TNF-α在實(shí)驗(yàn)組的各時間點(diǎn)表達(dá)較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組IL-1β、TNF-α表達(dá)在脊髓損傷后第7天表達(dá)最高，隨后逐漸下降，至28 d趨于穩(wěn)定。對照組各時間點(diǎn)的IL-1β、TNF-α表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物IL-10、Arginase-1在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)較對照組明顯增高，實(shí)驗(yàn)組各時間點(diǎn)均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組IL-10、Arginase-1表達(dá)在脊髓損傷后第14天表達(dá)最高，隨后逐漸下降，至28 d趨于穩(wěn)定；對照組各時間點(diǎn)的IL-10、Arginase-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

圖3 ELISA檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)果

2.5 巨噬細(xì)胞極化與膠質(zhì)瘢痕形成的一般規(guī)律 通過HE染色、免疫組化、免疫熒光等檢測發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕于損傷后28 d趨于穩(wěn)定，在這個過程中IL-1β、TNF-α的表達(dá)隨膠質(zhì)瘢痕形成而增加，于脊髓損傷后第7天達(dá)到峰值，而Arginase-1、IL-10在脊髓損傷后第14天達(dá)到峰值，損傷后28 d趨于穩(wěn)定。這說明脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的前7天巨噬細(xì)胞主要極化為M1型巨噬細(xì)胞，7d后巨噬細(xì)胞逐漸極化為M2型巨噬細(xì)胞，均于28d達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

3 討 論

脊髓損傷的治療是臨床醫(yī)生面臨的一個難題。盡管近年來采用移植替代法治療脊髓損傷取得了很大的進(jìn)步[2-3]，但仍未根本解決脊髓功能的恢復(fù)問題。其主要原因在膠質(zhì)瘢痕形成的原因未完全闡明，因此探討膠質(zhì)瘢痕形成的原因是治療脊髓損傷不可逾越的步驟。隨著基礎(chǔ)研究的深入，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕的形成與炎癥反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)，其中炎癥反應(yīng)是膠質(zhì)瘢痕形成過程中最重要的病理過程[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)鼠類脊髓損傷后，膠質(zhì)瘢痕形成一般在28 d左右即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[12]，因此本次研究將觀察時間點(diǎn)終止為脊髓損傷后28 d。

膠質(zhì)瘢痕形成的病理過程主要是神經(jīng)修復(fù)與抑制的過程。基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷的病理過程可以分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷病理過程[13-14]，繼發(fā)性損傷的損傷范圍及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)大于原發(fā)性損傷[15]，膠質(zhì)瘢痕形成主要在繼發(fā)性損傷病理過程中出現(xiàn)。繼發(fā)性損傷的主要原因有：損傷區(qū)域受損細(xì)胞的興奮性毒性、自由基、血管的破壞及炎癥反應(yīng)等[16-18]，其中炎癥反應(yīng)是膠質(zhì)瘢痕形成的主要原因，對脊髓損傷的預(yù)后至關(guān)重要[19]。

炎癥反應(yīng)主要影響脊髓損傷后軸突的再生及脊髓功能的恢復(fù)。脊髓損傷后局部微環(huán)境迅速發(fā)生改變，首先是嗜中性粒細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，隨后出現(xiàn)單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞累積[12-13]，巨噬細(xì)胞識別并清除受損部位不利于神經(jīng)修復(fù)的物質(zhì)，并促進(jìn)組織再生[14]，為膠質(zhì)瘢痕形成創(chuàng)造條件，減輕或防止繼發(fā)性損傷進(jìn)行擴(kuò)大。本次研究中我們發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物IL-1β、TNF-α在脊髓損傷前7天表達(dá)量逐漸上升，并于第7天達(dá)到峰值，這與脊髓膠質(zhì)瘢痕形成前7天炎癥反應(yīng)逐漸增加具有一致性；而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物IL-10、Arginase-1從脊髓損傷后7～14 d表達(dá)量逐漸增加，且14 d達(dá)到峰值，這與膠質(zhì)瘢痕形成于第7天炎癥反應(yīng)逐漸減輕具有一致性。有學(xué)者[19]通過構(gòu)建小鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，發(fā)現(xiàn)7 d后同側(cè)大腦皮質(zhì)分離的巨噬細(xì)胞由于還原型輔酶Ⅱ的表達(dá)被激活，可明顯抑制神經(jīng)元生長并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)發(fā)生。說明中樞神經(jīng)損傷后，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在損傷后也有阻礙神經(jīng)修復(fù)的作用。因此，巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后的修復(fù)扮演了雙重角色，無論是本次我們的研究還是上述其他研究，均提示其機(jī)制可能與脊髓損傷后局部微環(huán)境的改變導(dǎo)致巨噬細(xì)胞呈不同極化類型有關(guān)。

巨噬細(xì)胞的極化受不同的刺激因素和損傷區(qū)域的微環(huán)境差異而表現(xiàn)出不同的極化類型，分泌不同的細(xì)胞因子和趨化因子，產(chǎn)生不同的作用[20]。根據(jù)巨噬細(xì)胞極化的類型一般分為經(jīng)典活化M1型巨噬細(xì)胞和替代活化M2型巨噬細(xì)胞[21]。研究[16]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后，損傷部位存在M1和M2型巨噬細(xì)胞混雜并存的現(xiàn)象，通過對M1型和M2型巨噬細(xì)胞與脊髓組織共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Ml型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和硫酸軟骨素蛋白聚糖的分泌，有利于膠質(zhì)瘢痕的形成；M2型巨噬細(xì)胞無增殖星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，因而無促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕形成的作用。本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后7 d，M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物IL-1β、TNF-α呈最高表達(dá)，而M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物IL-10、Arginase-1在脊髓損傷后14 d才呈最高表達(dá)，這提示脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成過程中M1型和M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮了不同的作用。Fan等[22]認(rèn)為，脊髓損傷后M1型巨噬細(xì)胞通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)/MyD88信號途徑誘導(dǎo)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕形成。M2型巨噬細(xì)胞在脊髓損傷后較M1型巨噬細(xì)胞滯后，通過在脊髓損傷處移植M2型巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)明顯有促進(jìn)神經(jīng)軸突生長的作用[23]。其機(jī)制可能為極化后M2型巨噬細(xì)胞分泌大量纖維蛋白和基質(zhì)相關(guān)蛋白，抑制脊髓損傷后巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá)及其受體的活化，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和繼發(fā)的脊髓損傷，促進(jìn)脊髓損傷后內(nèi)皮細(xì)胞增生、血管形成和神經(jīng)功能恢復(fù)[24]。

膠質(zhì)瘢痕的形成和巨噬細(xì)胞的極化相輔相成，共同作用于脊髓損傷后的修復(fù)。脊髓損傷后形成的膠質(zhì)瘢痕主要由活化、增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞及其分泌的硫酸軟骨素蛋白聚糖組成[25]。在脊髓損傷早期膠質(zhì)瘢痕形成可以阻礙興奮性氨基酸、活性氧和自由基等有害分子對神經(jīng)元的進(jìn)一步破壞，抑制繼發(fā)性損傷擴(kuò)大[26]，這與巨噬細(xì)胞在脊髓損傷早期主要表現(xiàn)為促炎作用，清除局部壞死組織作用一樣。脊髓損傷后期，M2巨噬細(xì)胞通過一系列信號通路的調(diào)控，使促炎因子分泌減少，神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌增加，促進(jìn)殘存神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[27-28]，但是隨著膠質(zhì)瘢痕形成區(qū)域穩(wěn)定，殘存的軸突很難穿越瘢痕區(qū)域促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。因此，如何通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，減輕膠質(zhì)瘢痕的形成是促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的一個研究方向。

綜上所述，本次研究闡明了脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系，即在膠質(zhì)瘢痕形成早期主要為M1型巨噬細(xì)胞，膠質(zhì)瘢痕形成后期主要為M2型巨噬細(xì)胞，這將為通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化類型促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)提供一定的理論參考。但是，本研究也存在不足之處，膠質(zhì)瘢痕形成的過程是多個因素參與的生物化學(xué)過程，本次僅探索了巨噬細(xì)胞這一個因素，因而存在一定的不足；通過實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)整個膠質(zhì)瘢痕形成過程中M1型和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物均有表達(dá)，這說明M1型和M2型巨噬細(xì)胞或者更多的細(xì)胞參與了膠質(zhì)瘢痕的形成，如只對某一因素進(jìn)行干預(yù)，其效果可能有限。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞不同極化類型是如何影響膠質(zhì)瘢痕形成的。