基于UPLC/Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)探討糖尿病氣陰兩虛證生物標(biāo)志物*

楊宇峰，石巖

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由多種原因引起的以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病。胰島素分泌不足（絕對(duì)或相對(duì)）以及靶組織或器官對(duì)胰島素敏感性的降低皆可導(dǎo)致本病的發(fā)生。《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2020版）》中最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)DM發(fā)病率目前已高達(dá)11.2%，且近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)［1］。DM患者中以2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）為主，中醫(yī)藥治療DM尤其是T2DM的臨床優(yōu)勢(shì)突出，具有鮮明的診療特色，T2DM可以參照中醫(yī)內(nèi)科疾病中的消渴病辨證論治。消渴病多以稟賦異常、過(guò)食肥甘、多坐少動(dòng)，以及精神因素為發(fā)病原因，具體病機(jī)主要為內(nèi)熱，內(nèi)熱不僅可傷陰，又可耗氣，則成氣陰兩虛結(jié)熱之局，“傷陰耗氣”成為糖尿病病變的重要機(jī)理，貫穿疾病整個(gè)生物學(xué)變化過(guò)程［2］。

代謝組學(xué)是指通過(guò)對(duì)生物樣本中的低分子量代謝物（譜）進(jìn)行定性和定量研究，從而反映機(jī)體的代謝物圖譜，揭示生命活動(dòng)代謝本質(zhì)，屬于后基因時(shí)代的一門(mén)新興“組學(xué)”學(xué)科。與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)相比，代謝組學(xué)能夠更加準(zhǔn)確、直觀地描述機(jī)體的生理和生化狀態(tài)。目前，代謝組學(xué)已經(jīng)用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、判別中醫(yī)證型和評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)靶器官的效應(yīng)產(chǎn)生及一系列代謝過(guò)程和作用機(jī)制，在模型識(shí)別和確證、作用機(jī)制研究等方面具有理論意義和應(yīng)用價(jià)值［3］。

本次研究以T2DM氣陰兩虛證動(dòng)物模型為研究對(duì)象，通過(guò)超高效液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)分析各組模型大鼠差異代謝產(chǎn)物的種類(lèi)及變化情況，確定其所具有的特征性“信息譜”，查找潛在的生物標(biāo)志物，并與其分子基礎(chǔ)相關(guān)聯(lián)進(jìn)行生物信息分析，以期闡明T2DM氣陰兩虛證候的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑甲醇、乙腈，色譜純（美國(guó)Merck KGaA公司生產(chǎn)）；甲酸，色譜純（美國(guó)Tedia公司生產(chǎn)）；鏈脲佐菌素（批號(hào)：STZ-S0130，北京邦定泰克生物技術(shù)公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（購(gòu)自美國(guó)Waters公司），臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)：JX0130-F000，購(gòu)自日本Kubota公司，離心半徑5 cm），超純水儀（型號(hào)：Milli-Q Advantage A10，Merck KGaA公司）。

1.3 動(dòng)物雄性健康SPF級(jí)周齡10～12周的SD大鼠30只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2004-0019。實(shí)驗(yàn)室的溫度濕度保持在正常范圍內(nèi)，通風(fēng)良好，每天明暗各12 h。

2 方法

2.1 分組與造模大鼠用SPF級(jí)大鼠維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組，每組15只。模型組全程喂飼高脂高糖飼料，灌服200%青皮附子濃煎液（5 mL·kg-1·d-1），4周后，禁食不禁水12 h后腹腔注射小劑量STZ（30 mg·kg-1）。正常組給予普通飼料，灌服生理鹽水（5 mL·kg-1·d-1），4周后，腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。

2.2 模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（1）T2DM成模標(biāo)準(zhǔn)：①體質(zhì)量顯著減少；②空腹血糖升高；③餐后血糖升高；④胰島素抵抗。（2）中醫(yī)證候成模評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：①精神萎靡，倦怠懶動(dòng)；②體毛光亮度減退；③飲水增多，拉尾排便；④舌胖大，舌紅少津，苔白潤(rùn)。同時(shí)符合以上4項(xiàng)中的3項(xiàng)或全部者即可確定為T(mén)2DM氣陰兩虛證模型。

2.3 樣本制備與處理將符合評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的模型大鼠和正常組大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，劑量為3 mL·kg-1，然后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置1 h并進(jìn)行抗凝處理后，予10 000 r·min-1離心后取其上清液，凍存于-80℃冰箱。UPLC-Q-TOF-MS測(cè)定前，于室溫下解凍，取樣品100μL，加入色譜級(jí)乙腈-甲醇（1∶1）400μL，混勻振搖1 min，于4℃條件下進(jìn)行12 000 r·min-1離心10 min，取200μL上清液進(jìn)樣分析。

2.4 檢測(cè)條件①整個(gè)分析過(guò)程中樣品置于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，進(jìn)樣量5μL，柱溫40℃，流速0.4 mL·min-1；色譜流動(dòng)相A：水+（體積分?jǐn)?shù)）0.1%甲酸，色譜流動(dòng)相B：乙腈+（體積分?jǐn)?shù)）0.1%甲酸。②質(zhì)譜條件：每份樣品分別采用電噴霧電離（ESI）進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)，以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣，飛行管檢測(cè)模式V型。其ESI源條件如下：離子源溫度（source temperature）100℃、毛細(xì)管電壓（capillary voltage）3 KV、錐孔電壓（cone voltage）35 KV。離子掃描時(shí)間（Ion scan time）0.03 s，間隔時(shí)間（Interval time）0.02 s，數(shù)據(jù)采集范圍（Range of data collection）：50～1 000 m/z。

2.5 數(shù)據(jù)分析將所獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)MarkerLynx進(jìn)行預(yù)處理后，獲取三維矩陣圖。應(yīng)用軟件SIMCA-P11.5進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括無(wú)監(jiān)督主成分分析（principal component avalysis，PCA）分析、有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根據(jù)t檢驗(yàn)（P＜0.05）及VIP值＞1篩選潛在差異化合物。

3 結(jié)果

3.1 原始色譜圖檢查將所有質(zhì)控樣本正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的質(zhì)譜總離子流圖分別進(jìn)行譜圖疊加比較，如圖1所示：各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，說(shuō)明整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器誤差引起的變異較小，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

圖1 模型組和正常組大鼠血清樣本UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖

3.2 模式識(shí)別分析采用PCA和PLS-DA方法對(duì)全部樣本的UPLC/Q-TOF-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，圖2為PCA分析結(jié)果，模型組和正常組樣本出現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)，圖3為進(jìn)行PLS-DA方法分析的結(jié)果，同樣模型組和正常組樣本出現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)，說(shuō)明兩組的代謝物存在顯著差異。通常情況下如果R2和Q2越接近1，則表明模型越穩(wěn)定可靠，反之可靠性較差，本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為（R2X＝0.728，R2Y＝0.918，Q2＝0.953），說(shuō)明其數(shù)據(jù)可靠性極高。

圖2 兩組大鼠血清樣本PCA分析圖（n=6）

圖3 兩組大鼠血清樣本PLS-DA分析圖（n=6）

3.3 顯著性差異代謝物的篩選根據(jù)模型組和正常組大鼠血清生物標(biāo)記物進(jìn)行PCA聚類(lèi)loading圖的分析結(jié)果及離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)分組貢獻(xiàn)最大的原則，同時(shí)滿(mǎn)足VIP＞1、t檢驗(yàn)（P＜0.05），篩選差異顯著的代謝產(chǎn)物，如圖4所示。檢索人類(lèi)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）和京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）鑒定差異代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠血清有41種代謝物變化較為顯著，如表1所示。支鏈氨基酸等代謝物水平顯著降低，硬脂酸等代謝物水平顯著上升。

圖4 模型組和正常組大鼠血清樣本PCA聚類(lèi)Loading圖

表1 篩選出的潛在生物標(biāo)志物及其變化趨勢(shì)

3.4 代謝通路分析將上述經(jīng)篩選得到的生物標(biāo)志物導(dǎo)入到Metaboanalyst 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6條通路與疾病相關(guān)，分別為：三羧酸循環(huán)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及能量和碳水化合物的代謝、氧化應(yīng)激。碳水化合物代謝涉及糖原異生和糖原生成的合成代謝途徑，以及糖原分解和糖酵解的分解代謝途徑。脂質(zhì)代謝涉及脂肪酸生成及氧化分解代謝途徑。蛋白質(zhì)代謝涉及氨基酸合成代謝途徑和氨基酸氧化分解代謝途徑。

4 討論

根據(jù)IDF在2019年發(fā)布的報(bào)告顯示：中國(guó)的DM發(fā)病率居世界首位，預(yù)計(jì)到2045年支出在DM的費(fèi)用約為1 820億美元［4］。根據(jù)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究其發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)出療效良好且價(jià)格低廉的藥物是有關(guān)DM研究的熱點(diǎn)。代謝組學(xué)可以對(duì)一定生理狀態(tài)或特定條件下的樣本中所有代謝物進(jìn)行綜合全面、無(wú)偏性的高覆蓋檢測(cè)，可尋找和鑒定出不同樣品的差異代謝物，從而實(shí)現(xiàn)代謝特征的比較［5］，為精準(zhǔn)研究T2DM常見(jiàn)中醫(yī)證型-氣陰兩虛型模型大鼠與正常大鼠的差異代謝產(chǎn)物提供了可行性。

本研究使用STZ聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，STZ是一種亞硝基脲類(lèi)似物，1963年首次被報(bào)道具有DM的致病性［6］，其小劑量單次給藥適合誘導(dǎo)T2DM模型，肥胖是T2DM重要的病因［7］，DM尤其是T2DM早期患者大多會(huì)出現(xiàn)以高胰島素血癥、胰島素抵抗和血脂異常為特征的肥胖狀態(tài)［8-9］，故在STZ注射前使用高脂飼料全程喂養(yǎng)是造模成功的關(guān)鍵因素。相關(guān)文獻(xiàn)還顯示：8周高脂飼料喂養(yǎng)后進(jìn)行STZ造模后生活質(zhì)量較差，4周更佳，并可減少死亡率，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本［10］；SD大鼠造模死亡率小于Wistar大鼠［11］；雄性大鼠比雌性大鼠對(duì)于STZ更加敏感［12-13］。上述研究結(jié)果可以作為本次小劑量STZ誘導(dǎo)的參考依據(jù)。使用青皮附子濃煎液灌胃可以最大程度真實(shí)模擬T2DM“傷陰耗氣”的發(fā)病過(guò)程，為目前氣陰兩虛證型造模的最佳選擇。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，T2DM氣陰兩虛證模型的代謝表達(dá)譜有明顯差異，其中11條與脂質(zhì)代謝相關(guān)，10條與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)，8條與碳水化合物代謝相關(guān)，7條與氧化應(yīng)激損傷代謝相關(guān)，5條與能量代謝相關(guān)。

4.1 碳水化合物代謝與正常組相比，模型組乳酸（lactic acid），山梨糖醇（sorbitol），D-塔格糖（Dtagatose）的水平顯著增加；1，5-脫水葡萄糖醇（1，5-anhydroglucitol，1，5-AG），D-赤蘚糖（Derythrose），D-半乳糖，磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯（gluconophosphate），1，6-二磷酸果糖（1，6-phosphate fructose）水平顯著降低。這些代謝產(chǎn)物與乳糖降解、多元醇代謝、半乳糖代謝、戊糖磷酸途徑、糖酵解代謝、糖異生等密切有關(guān)。其中山梨糖醇是葡萄糖的醛基還原而形成的山梨醇與半乳糖醇，模型組高血糖引起的異常山梨醇代謝增加了山梨醇在機(jī)體內(nèi)的蓄積。1，5-AG是一個(gè)反映長(zhǎng)期血糖穩(wěn)定控制的標(biāo)志物，在血清水平與循環(huán)葡萄糖成反比［14］，其在模型組內(nèi)的水平顯著下降，一方面反映模型的復(fù)制成功，另一方面提示模型組大鼠存在嚴(yán)重的糖代謝紊亂。

4.2 脂質(zhì)代謝相關(guān)研究已經(jīng)確定脂肪酸是糖尿病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。本實(shí)驗(yàn)在模型組中觀察到多種游離脂肪酸（包括中鏈、長(zhǎng)鏈、飽和、不飽和、多不飽和、支鏈和二羧酸脂肪酸）水平異常。其中模型組棕櫚酸（palmitic acid）、硬脂酸（stearic acid）、油酸（oleic acid）、亞油酸（linoleic acid）、月桂酸（lauric acid）、甘油磷酸鹽（glycerol phosphate）顯著升高。棕櫚酸是人體血清中豐富的飽和脂肪酸，研究報(bào)道棕櫚酸水平與T2DM風(fēng)險(xiǎn)之間存在正相關(guān)［15］。月桂酸和甘油磷酸鹽增加是由于脂肪組織中三酰甘油的快速動(dòng)員導(dǎo)致血清游離脂肪酸水平增加?；ㄉ南┧岽x在T2DM的病理生理學(xué)中發(fā)揮潛在作用，花生四烯酸（arachidonic acid）可轉(zhuǎn)化為前列腺素，白三烯和脂氧素，其中前列腺素-E和白三烯是有效的促炎性脂質(zhì)介質(zhì)［16］。模型組氧化脂質(zhì)如5-羥過(guò)氧化二十碳四烯酸（5-hydroxyperoxytetradecanoic acid）是體內(nèi)白三烯生物合成過(guò)程中，花生四烯酸到白三烯A4的中間物質(zhì)，參與介導(dǎo)炎癥并誘導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮上的黏附和活化。?；鈮A（acylcarnitine）的升高可能與脂肪酸的β-氧化增加或肝臟和肌肉組織中的線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)，因?yàn)橹舅崤c肉毒堿的結(jié)合需要跨線(xiàn)粒體膜運(yùn)輸和隨后的β-氧化［17］。3-羥基丁酸（3-hydroxybutyric acid，AHB）的水平顯著增加，研究表明AHB是胰島素抵抗的重要標(biāo)志物，是α-酮丁酸通過(guò)乳酸催化反應(yīng)脫氫酶或α-羥基丁酸脫氫酶代謝的產(chǎn)物［18］。

4.3 蛋白質(zhì)代謝胰島素通過(guò)增加蛋白質(zhì)合成速率并降低蛋白質(zhì)降解速率，對(duì)蛋白質(zhì)代謝發(fā)揮重要的調(diào)控作用。模型組大鼠的蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)了胰島素抵抗，升高的支鏈氨基酸BCAAs（異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸）以及一些芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）是人類(lèi)和動(dòng)物模型中T2DM的重要預(yù)測(cè)因子，BCAAs通過(guò)調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物靶標(biāo)（mTORC）影響胰島素敏感性。已有研究表明BCAAs首先激活mTORC1和下游靶核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）［19］，S6K1通過(guò)抑制胰島素受體底物1信號(hào)傳導(dǎo)影響胰島素敏感性［20］。BCAAs還可促進(jìn)肝臟和骨骼肌中的葡萄糖攝取，增加糖原合成［21］。一些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物如來(lái)自半胱氨酸的?；撬幔╰aurine）和來(lái)自谷氨酰胺的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）也在模型組中升高，可能與模型組喂飼高脂高糖膳食破壞機(jī)體骨骼肌中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而引起胰島素抵抗有關(guān)。模型組甘氨酸（glycine）水平減少與胰島素抵抗密切相關(guān)，胰島素抵抗可導(dǎo)致機(jī)體δ-氨基乙酰丙酸合酶1表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而催化甘氨酸和琥珀酰-CoA縮合成5-氨基乙酰丙酸，從而降低甘氨酸水平［22］。

4.4 氧化應(yīng)激研究表明T2DM氣陰兩虛證模型存在著明顯的氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激被認(rèn)為在IR中起關(guān)鍵作用，IR情況下，線(xiàn)粒體β氧化能力處于飽和狀態(tài)，這是由于脂質(zhì)向肌肉組織的遞送增加所致，從而使生物活性脂質(zhì)衍生的代謝物如二酰基甘油（diacylglycerol）和神經(jīng)酰胺（ceramide）在線(xiàn)粒體空間積累，并促進(jìn)絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化來(lái)抑制IRS-1酪氨酸磷酸化［23］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的2-氨基己二酸（2-aminoadipate）是賴(lài)氨酸降解的中間代謝產(chǎn)物，具有胰島素促分泌素的作用，并且已被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物［24］。除此，幾種氧化應(yīng)激標(biāo)志物包括還原型谷胱甘肽（reduced glutathione），蛋氨酸砜（methionine sulfone）和蛋氨酸亞砜（methionine sulfoxide），羥基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecadienoic acid）也在模型組中被發(fā)現(xiàn)水平升高。

4.5 能量代謝T2DM氣陰兩虛證模型存在明顯能量缺乏狀態(tài)，其代謝特征最顯著變化是葡萄糖氧化代謝減少和脂肪酸β氧化代謝增加，增加的脂肪酸氧化補(bǔ)償葡萄糖氧化缺陷所產(chǎn)生ATP，表現(xiàn)為模型組檸檬酸（citric acid），L-蘋(píng)果酸（L-malic acid），α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid），琥珀酸（succinic acid），富馬酸（fumaric acid）與正常水平相比顯著降低。模型組肌酸酐（creatinine）增加，表明磷酸肌酸中更多的高能磷酸鍵被轉(zhuǎn)移形成ATP以滿(mǎn)足能量需求，并證實(shí)了模型組存在三羧酸（TCA）循環(huán)異常。此外，模型組增加的3-羥基丁酸酯（3-hydroxybutyrate）（脂肪酸β-氧化和BCAA分解代謝產(chǎn)物）表明能量代謝改變與糖酵解破壞和脂解作用增加正相關(guān)［25］。

綜上，本研究通過(guò)整體分析T2DM氣陰兩虛證模型生物樣本中小分子代謝物，同時(shí)應(yīng)用多維統(tǒng)計(jì)、生物信息學(xué)等數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)并結(jié)合相關(guān)性研究，探尋T2DM氣陰兩虛證相關(guān)的代謝標(biāo)記物和代謝模式，為揭示DM中醫(yī)證型本質(zhì)和闡明其發(fā)病機(jī)理提供了新的思路和依據(jù)，從而進(jìn)一步促進(jìn)DM中醫(yī)證候分子機(jī)制的深入研究和探討。