平喘顆粒對(duì)哮喘小鼠肺組織TLR2和TLR4表達(dá)的影響*

王玨，李竹英

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分相互作用導(dǎo)致的慢性氣道炎癥性疾病，發(fā)病過程中受到炎性介質(zhì)的不斷刺激而觸發(fā)氣道壁損傷和氣道結(jié)構(gòu)變化。因此，抑制氣道炎癥反應(yīng)是防治哮喘的一個(gè)重要方向。流行病學(xué)顯示，我國哮喘患病人數(shù)約4 570萬，總體發(fā)病率達(dá)4.2%［1-2］。平喘顆粒是國家級(jí)名老中醫(yī)劉建秋教授傳承前輩思想并結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立，劉教授認(rèn)為哮喘慢性持續(xù)期的病機(jī)根本為“陽虛痰盛”，故以“溫陽益氣，化痰平喘”為核心思想，組方平喘顆粒用于哮喘慢性持續(xù)期的臨床治療。前期研究發(fā)現(xiàn)，平喘顆粒可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成、干預(yù)上皮細(xì)胞自噬與凋亡改善哮喘的病理進(jìn)程［3-5］。本研究通過觀察平喘顆粒對(duì)哮喘小鼠肺組織Toll樣受體2（toll-like receptor2，TLR2）和TLR4表達(dá)及相關(guān)炎性因子的影響，探討平喘顆粒對(duì)哮喘的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物8周齡健康清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠30只，體質(zhì)量（20±2）g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。

1.2 藥物與試劑平喘顆粒［淫羊藿200 g，太子參150 g，黃芪150 g，五味子150 g，知母100 g，麻黃（炙）100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g］（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，批號(hào)：20180723）。白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13 ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為：70-EK204/2-96、70-EK205-96、70-EK213/2-96）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（上海生工生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：A003056-0100）；烏拉坦（美國Sigma公司，貨號(hào)：U2500-100G）；40 ng·L-1多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0099）；蘇木精、伊紅染色液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)分別為：H8070、G1100）；PVDF膜（上海谷研生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GOY-C3192）；細(xì)胞裂解液（上海梵態(tài)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：FT-LG1227）；PMSF（北京伊塔生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：YT1705）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、TLR2抗體、TLR4抗體（美國Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab102536、ab209216、ab22048）；內(nèi)參β-actin抗體（圣克魯斯生物技術(shù)公司，貨號(hào)：sc-47778）。

1.3 儀器Proline微量移液器［芬蘭百得實(shí)驗(yàn)室儀器（中國）有限公司］；ELX-800型酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；Lx81型倒置熒光顯微鏡（日本Olymps公司）；OLB-200B型水平搖床（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；165-8001型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）；CM69001型-30℃恒冷低溫切片機(jī)（德國Leica公司）；DWHL-668型-70℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型復(fù)制將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、平喘顆粒組，每組10只。模型組和平喘顆粒組采用腹腔注射加霧化OVA致敏液［100μg OVA+1 mg Al（OH）3］制備慢性哮喘小鼠模型［6］，分別于第1天、第14天腹腔注射0.2 mL致敏液，第22天后改用1%OVA溶液進(jìn)行霧化，激發(fā)30 min，每周3次，連續(xù)激發(fā)8周。對(duì)照組用生理鹽水代替OVA激發(fā)，平喘顆粒組從第1次霧化激發(fā)的當(dāng)天開始，每天灌胃給予平喘顆粒藥液，持續(xù)給藥8周，激發(fā)階段每次激發(fā)前1 h灌胃，對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，給藥時(shí)間同平喘顆粒組。

2.2 血清中IL-4、IL-5、IL-13水平的檢測于末次激發(fā)24 h后，采用20%烏拉坦（5 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，摘眼球取血并制備血清，檢測血清中IL-4、IL-5、IL-13水平。

2.3 HE染色觀察肺的病理變化每組隨機(jī)選5只小鼠，開胸取小鼠右肺的前葉及中葉部分，分離肺組織，用40 ng·L-1多聚甲醛固定保存。將固定后的組織石蠟包埋后切片，脫蠟，水洗后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察各組小鼠肺組織的病理學(xué)改變。

2.4 Western blot法檢測肺組織TLR2、TLR4的表達(dá)每組隨機(jī)取5只小鼠的肺組織，提取肺組織總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、曝光。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織的病理變化對(duì)照組小鼠肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)正常，肺泡輪廓清晰；模型組小鼠肺組織及支氣管外周可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)異常；平喘顆粒組小鼠肺組織上述病理改變減輕，但與對(duì)照組仍有差距，肺組織及支氣管外周可見多個(gè)中等大小的炎性細(xì)胞浸潤灶，肺泡結(jié)構(gòu)不完整。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)損傷（HE，×200）

3.2 小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平的檢測與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，平喘顆粒組小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平

3.3 小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，平喘顆粒組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達(dá)

圖4 各組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達(dá)

4 討論

平喘顆粒是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制的中藥制劑，全方共由9味中藥組成。方中麻黃溫通宣肺平喘，淫羊藿入腎經(jīng)振奮陽氣，二者為君，陽氣通達(dá)，肺臟宣散之氣得以肅降，腎臟氣化功能得以恢復(fù)。五味子入肺腎二經(jīng)，斂肺止咳，太子參補(bǔ)脾肺氣陰，兼化痰止咳，黃芪補(bǔ)脾升陽。款冬花宣肺止咳，地龍瀉熱平喘，以上5味中藥共為臣藥。罌粟殼酸澀收斂，可斂肺氣以止咳，同時(shí)防止君藥辛散耗氣，為佐藥。知母甘寒養(yǎng)陰，潤肺止咳，可降肺之氣逆，引諸藥歸經(jīng)，為使藥。方中藥物配伍升降有序、陰陽同補(bǔ)、收散并用，補(bǔ)益氣血、溫化痰濕、宣暢氣機(jī)，共奏溫陽益氣、化痰平喘之功。研究表明，麻黃、五味子、款冬花、地龍均具有抗炎、平喘、鎮(zhèn)咳等作用［7-11］。金華良等［12］研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可降低哮喘大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13水平，從而抑制氣道炎癥。

哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變，常伴隨著多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的參與，故免疫調(diào)節(jié)失衡是哮喘的主要致病因素之一。目前普遍認(rèn)為哮喘的免疫調(diào)節(jié)失衡主要為Th1/Th2亞群比例失衡，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞數(shù)目增多和功能亢進(jìn)。Th2細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)初始效應(yīng)細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化，產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致氣道慢性炎癥的發(fā)生［13-14］。病理學(xué)觀察顯示，平喘顆粒可減輕哮喘小鼠的肺部炎性病變。研究表明，哮喘患者血清中IL-4、IL-13水平與IgE的含量及病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性［15-17］。IL-5可增加嗜酸性粒細(xì)胞的敏感性，刺激其增殖分化，促進(jìn)組胺的釋放，導(dǎo)致哮喘的加重［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，平喘顆?？山档拖∈笱逯蠭L-4、IL-5和IL-13水平，改善哮喘的炎癥反應(yīng)。

Toll樣受體是介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的細(xì)胞膜受體，其中以TLR2、TLR4表達(dá)范圍最為廣泛，可識(shí)別微生物病原體，促進(jìn)多種炎性細(xì)胞及因子的釋放，與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)［20-22］。TLR2表達(dá)于多種免疫細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞中，可通過介導(dǎo)下游的NF-κB通路和NLRP3炎癥小體參與過敏性氣道炎癥［23-24］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2激動(dòng)劑可增加哮喘小鼠Th2類相關(guān)因子，如IL-5、IL-13的水平，進(jìn)而加重哮喘的Th2免疫反應(yīng)［25-26］。TLR4在哮喘患者體內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等釋放細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，激發(fā)T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生［27-28］。研究顯示，TLR4基因敲除可減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥和氣道重塑，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2及RORγt/Foxp3細(xì)胞因子的平衡有關(guān)［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，平喘顆?？山档托∈蠓谓M織TLR2和TLR4蛋白表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫失衡。

綜上所述，平喘顆粒可緩解哮喘氣道炎癥，其機(jī)制可能與調(diào)控TLR2、TLR4表達(dá)，從而抑制Th2細(xì)胞活化有關(guān)。哮喘是一種多種病理因素的復(fù)雜疾病，本文雖然探討了平喘顆粒在改善氣道炎癥方面的相關(guān)機(jī)制，但在哮喘作用機(jī)制方面仍有許多值得研究的領(lǐng)域，如氣道重塑、氣道高反應(yīng)性、氧化應(yīng)激等，平喘顆粒是否與這些作用機(jī)制有關(guān)，還需要進(jìn)行深入探索。