黃芪甲苷對幽門螺桿菌定植相關因子的影響*

王平，趙澄，吳濤，張香港，盧芳國，吳碧清，吳賢倩，陳麗玄，鮑杰

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）已被證實是慢性胃炎和消化性潰瘍的病因之一，且與胃癌的發(fā)生密切相關［1］。成功定植于胃黏膜是H.pylori感染的首要條件，而黏附又是定植的關鍵［2］。鞭毛動力、尿素酶活性和黏附素是H.pylori在胃內(nèi)得以生存和定植的重要原因，與H.pylori致病性密切相關，成為根治H.pylori感染的重要靶點［3-4］。中醫(yī)藥治療在改善癥狀、提高幽門螺桿菌根除率、降低幽門螺桿菌復發(fā)率等方面有較大優(yōu)勢［5］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪（Astragali Radix）對H.Pylori相關性胃炎和消化性潰瘍的治療效果顯著，但具體機制不清［6］。黃芪甲苷（Astragaloside IV，ASIV）是一種四環(huán)三萜類皂苷，為黃芪的主要活性成分，本實驗通過觀察ASIV對H.pylori尿素酶活性、鞭毛運動功能及定植相關基因表達的影響，初步探討ASIV抗H.Pylori定植的可能機制，為黃芪及其活性成分的進一步開發(fā)利用提供理論和實驗支持。

1 材料

1.1 菌株H.Pylori ATCC26695菌株由貴州醫(yī)科大學微生物學教研室惠贈，由課題組保管于貴州中醫(yī)藥大學形態(tài)實驗室。

1.2 藥物及試劑ASIV（大連美侖生物技術有限公司，批號：MB1955，純度＞98%）；H.Pylori固體培養(yǎng)基、布氏肉湯干粉、腦心浸液肉湯干粉、H.Pylori添加劑（青島海博生物技術有限公司，批號：HB8646、HB0241、HB8297-1、HB8646a）；DMSO（北京索萊寶科技有限公司，批號：D8370）；無菌脫纖維羊血（常德比克曼生物科技有限公司）；過氧化氫酶試劑、氧化酶試紙片（青島海博生物技術有限公司，批號：HB8650、HB2100）；尿素酶試紙（珠海市克迪科學技術開發(fā)公司，批號：121102）；無菌PBS緩沖液（美國HyClone公司，批號：SH30256.01）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：PC0020）；細菌總蛋白提取試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號：BB3123-2）；細菌尿素酶比色法定量檢測試劑盒（美國GENMED公司，批號：GMS15022.2）；細菌總RNA提取試劑盒（離心柱型）（北京天根生化科技有限公司，批號：DP430）；cDNA合成試劑盒、NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（上海近岸蛋白質科技有限公司，批號：E047、E096）；目的基因PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；內(nèi)參基因（16S rRNA基因）引物參照文獻［7］由長沙維爾生物有限公司合成。

1.3 儀器BSC-1300ⅡA2生物安全柜、SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；TP-200D電子分析天平（湘儀天平儀器設備有限公司）；TGL 20M高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；多功能酶標儀（美國Bio-tek公司）；LightCycler熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Scientz-650E超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；麥氏比濁儀（法國Biomerieux SA公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備嚴格參照說明書要求進行。固體培養(yǎng)基：取H.Pylori固體培養(yǎng)基5.2 g，加入93 mL純水，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至56℃左右，加入無菌脫纖維羊血7 mL及H.pylori添加劑1支，混勻，傾倒于90 mm無菌平皿中，培養(yǎng)基厚度約為3～4 mm，4℃?zhèn)溆谩：幣囵B(yǎng)基：根據(jù)計算出的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的1/2、1/4、1/8分別加入ASIV，與上述成分充分混勻后分裝至直徑90 mm的無菌平皿中，4℃?zhèn)溆谩０牍腆w培養(yǎng)基：取布氏肉湯干粉2.81 g，加入100 mL純水，0.3 g瓊脂，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至56℃左右，加入無菌脫纖維羊血7 mL及H.pylori添加劑1支，含藥培養(yǎng)基按上述濃度加入ASIV充分混勻后，分裝至直徑為90 mm的無菌平皿中，培養(yǎng)基厚度約為3～4 mm。液體培養(yǎng)基：腦心浸液肉湯干粉3.85 g，加無菌純水90 mL，高壓滅菌，冷卻后加10 mL胎牛血清，分裝，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 幽門螺桿菌鑒定在微需氧環(huán)境中（培養(yǎng)罐中放置微需氧袋）培養(yǎng)H.pylori 48～72 h，連續(xù)培養(yǎng)3代，通過觀察其菌落形態(tài)、生化試驗（觸酶試驗、氧化酶試驗、快速尿素酶試驗）及革蘭染色對H.pylori進行鑒定［8］。觸酶試驗：根據(jù)說明書操作，接種環(huán)挑取細菌菌落涂布于潔凈玻片上，在菌落上滴加3%過氧化氫1滴，觀察有無氣泡產(chǎn)生，如有氣泡產(chǎn)生，判斷為陽性。氧化酶和快速尿素酶試驗：接種環(huán)滅菌后刮取平板中疑似菌落放于氧化酶試紙片或快速尿素酶試紙條上，30 s至2 min內(nèi)觀察結果。氧化酶試紙在30 s內(nèi)變?yōu)樗{色或藍紫色為強陽性，2 min不變色為陰性；快速尿素酶試紙在1～2 min內(nèi)變紅，則尿素酶試驗為陽性，如果試紙條顏色不變，則尿素酶試驗為陰性。

2.3 瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度采用瓊脂稀釋法測定ASIV的MIC，具體如下：刮取培養(yǎng)48～72 h H.pylori接種于液體培養(yǎng)基中，用無菌生理鹽水將其稀釋至1.5×108CFU·mL-1。滴加200μL菌液于培養(yǎng)基表面，用涂布棒均勻接種于不同終濃度ASIV（10 g·L-1、5 g·L-1、2.5 g·L-1、1.25 g·L-1）的含藥平板上，37℃微需氧培養(yǎng)72h后觀察，以未出現(xiàn)H.pylori生長的最低藥物濃度為MIC。

2.4 尿素酶蛋白活性檢測將1.5×108CFU·mL-1H.pylori菌液200μL分別涂布于空白平皿及含1/2、1/4、1/8 MIC 3個不同濃度ASIV的平皿中，微需氧傳代培養(yǎng)3代，用無菌PBS將平板菌株洗脫并收集到無菌離心管中，4℃、5 000 r·min-1離心5 min，去上清，收集菌體，用細菌細胞漂洗液將細胞懸浮起后，4℃、12 000 r·min-1離心2 min，去除漂洗液，重復2次，加入細菌細胞蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，混懸細菌細胞樣品，37℃搖床溫育20 min，置冰上放入超聲破碎儀，300 w、10 s超聲/10 s間隔超聲20 min，至菌液變清后，4℃、10 000 r·min-1離心15 min，上清即含蛋白質粗提物。取上清，BCA法測定蛋白質含量。根據(jù)GENMED細菌尿素酶活性比色法定量檢測試劑盒說明書制備標準曲線，并進行樣品尿素酶活性檢測。

尿素酶活性抑制率＝（對照組尿素酶活性-實驗組尿素酶活性）/對照組尿素酶活性×100%

2.5 細菌鞭毛動力定量檢測參照文獻［7］方法，收集培養(yǎng)48 h且生長狀態(tài)良好的H.pylori懸于腦心浸液，比濁儀調整菌液濃度至3×108CFU·mL-1，4℃?zhèn)溆?。用接種針取菌液穿刺接種于含不同濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）ASIV的布氏肉湯半固體培養(yǎng)基平皿中，相同濃度各接種3個，以不含藥培養(yǎng)基作為陰性對照。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測量各組H.pylori菌膜暈圈直徑。

2.6 實時熒光定量PCR檢測幽門螺桿菌黏附定植相關基因的表達水平H.pylori在3個濃度含藥平板上培養(yǎng)48 h后，設為實驗組（ASIV大劑量組、ASIV中劑量組、ASIV小劑量組），同批未經(jīng)ASIV處理的H.pylori設為對照組。用腦心浸液將H.pylori制成1～9×108CFU·mL-1細菌懸液，采用離心柱法提取各組樣品的總RNA。利用多功能酶標儀檢測樣品在波長260 nm與280 nm處的吸光度值A260與A280。選擇A260/A280值在1.8～2.0之間的樣品，用RNase Freed H2O將樣品濃度調整至500～600 mg·L-1，逆轉錄成cDNA，以cDNA做模板，按NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒說明，分別加入16S rRNA、ureA、ureB、flaA、flaB、babA、sabA、alpA、alpB引物進行擴增。PCR反應體系為：cDNA 2μL，UltraSYBR Mixture（Low ROX）25μL，10μM上下游引物各1μL，以dd H2O補足至50μL。反應條件：95℃10 min，95℃10 s，60℃1 min，40個循環(huán)，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。方差齊時，用LSD進行多重比較，方差不齊時用Games-Howell進行多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1H.pylori在固體培養(yǎng)基上生長現(xiàn)象觀察及革蘭氏染色結果在固體培養(yǎng)基上H.pylori菌落為直徑1～2 mm的透明針尖樣菌落，均勻散在分布。經(jīng)涂片、固定、革蘭染色后油鏡下觀察，呈紅色彎曲狀或短桿狀。觸酶試驗、氧化酶試驗和快速尿素酶試驗均為陽性。結果見圖1、圖2。

圖1 幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基生長現(xiàn)象

圖2 幽門螺桿菌鏡下形態(tài)（×1 000）

3.2 最小抑菌濃度測定瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度發(fā)現(xiàn)，在10 g·L-1、5 g·L-1ASIV含藥平板中未培養(yǎng)出H.pylori，即5 g·L-1為MIC值。根據(jù)結果制備1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 3個藥物濃度的含藥平板，即2.5 g·L-1、1.25 g·L-1、0.625 g·L-1，分別為ASIV的小、中、大劑量。

3.3 ASIV對H.pylori尿素酶活性的影響與對照組比較，ASIV大劑量組和中劑量組尿素酶活性顯著降低（P＜0.05）。提示ASIV對H.pylori尿素酶活性具有抑制作用。結果見表2，圖3。

表2 ASIV對H.pylori尿素酶活性的影響 （±s）

表2 ASIV對H.pylori尿素酶活性的影響 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01

組別 尿素酶活性/mU·min-1 抑制率/%對照組322.14±26.42 -ASIV小劑量組 301.30±26.22 6.47±2.89 ASIV中劑量組 262.77±36.17* 18.01±11.82 ASIV大劑量組 234.99±32.56**27.05±10.10

圖3 ASIV對幽門螺桿菌尿素酶活性的影響

3.4 ASIV對H.pylori鞭毛動力的影響與對照組比較，ASIV大、中、小劑量組H.pylori菌膜暈圈直徑減小，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示ASIV對幽門螺桿菌鞭毛動力無明顯影響。結果見表3。

表3 ASIV對H.pylori菌膜暈圈直徑的影響 （±s）

表3 ASIV對H.pylori菌膜暈圈直徑的影響 （±s）

組別 菌膜暈圈直徑（l/mm）17.80±2.58 ASIV小劑量組 17.20±1.87 ASIV中劑量組 15.80±1.48 ASIV大劑量組對照組15.00±3.53

3.5 ASIV對H.pylori定植相關基因表達水平的影響以16S rRNA基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT對ASIV作用后H.pylori定植相關基因表達差異進行分析。與對照組比較，ASIV大劑量組尿素酶基因ureA和ureB的表達顯著降低（P＜0.05），而其他定植相關基因表達未見明顯差異（P＞0.05）。提示ASIV可通過抑制尿素酶基因表達影響幽門螺桿菌的定植。見圖4。

圖4 黃芪甲苷對幽門螺桿菌定植相關基因mRNA表達的影響

4 討論

H.pylori是一種螺旋狀革蘭氏陰性微需氧菌，主要定植于胃黏膜上皮細胞表面，全球有超過50%的人群感染，大多數(shù)感染者沒有癥狀，但少數(shù)感染者可發(fā)展為慢性胃炎和消化性潰瘍，極少數(shù)感染者可發(fā)生胃癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤［9］。尿素酶活性、鞭毛動力及黏附素的表達是幽門螺桿菌在胃內(nèi)得以生存，并實現(xiàn)黏附定植的前提，與H.pylori致病性密切相關［10］。H.pylori尿素酶可以水解尿素生成氨和二氧化碳，氨溶于水生成氫氧化銨，調節(jié)胃內(nèi)pH值，緩解酸性環(huán)境，使H.pylori可以安全通過胃液。H.pylori尿素酶由尿素酶基因簇ureA/B、ureI、ureE-H等基因編碼，其中ureA/B具有高度保守性，是PCR檢測常選擇的目的基因［11］。同時，尿素酶還可以誘導中性粒細胞和單核細胞聚集，促進IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的產(chǎn)生［12］。因此，尿素酶在細菌定植及誘導炎癥反應中發(fā)揮重要作用。鞭毛運動是H.pylori定植的關鍵因素，由鞭毛和菌體組成的特殊螺旋結構，為H.pylori提供了省力的形態(tài)學結構并為其穿梭胃黏液層定植于胃黏膜提供了便利條件。在鞭毛的作用下，H.pylori可通過胃黏膜上皮層向pH值接近7.0的基底層移動［13］。H.pylori一端有4～7條鞭毛，主要由基體、鞭毛鉤及鞭毛絲組成。鞭毛絲又由FlaA和FlaB兩種鞭毛蛋白組成，分別由flaA和flaB兩種基因編碼產(chǎn)生。若同時缺乏FlaA和FlaB，鞭毛和動力均消失，H.pylori失去致病性［14］。胃內(nèi)定植是H.pylori致病的前提，而黏附是定植的關鍵［15］，H.pylori的黏附作用主要是通過特異性黏附素介導［16］。目前已發(fā)現(xiàn)20多種黏附素，包括血型抗原結合黏附素（blood-group antigen-binding adhesion，BabA）、唾液酸結合黏附素（sialic acid-binding adhesion，SabA）、黏附相關脂蛋白A和B（The adherence-associated lipoprotein A and B，AlpA/B）等，分別由黏附素基因babA、sabA、alpA、alpB編碼。其中，BabA是研究比較明確的黏附素，能與胃黏膜上皮細胞表達的血型抗原Lewis b相結合［17］。SabA是一種細菌表面蛋白，主要與H.pylori感染后的炎癥反應和持續(xù)黏附有關［18］。AlpA、AlpB是兩種具有特異性黏附功能的外膜蛋白，主要與宿主的黏連蛋白結合介導細菌對胃黏膜上皮的黏附［19］。在黏附素基因突變情況下，幽門螺桿菌黏附能力明顯降低，失去致病性。

近年來，H.pylori對抗生素的耐藥性增強成為H.pylori根除治療失敗的主要原因［20］。中西醫(yī)結合治療可提高H.pylori根除率或改善患者癥狀，提高消化性潰瘍愈合質量［21］。目前已發(fā)現(xiàn)多種中藥或其有效成分可通過干預H.pylori致病的多個生理病理環(huán)節(jié)發(fā)揮抗H.pylori作用［22］。

黃芪（Astragali Radix）為一類臨床上應用較為廣泛的補益類中藥材，性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，具有補氣升陽、益氣固表、托毒生肌、利水退腫的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有增強和調節(jié)免疫功能、廣譜抗病毒、抗衰老、清除過剩氧自由基等作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃芪與桂枝、白芍、甘草、生姜等配伍的黃芪建中湯加減方有很好的抗H.pylori療效［6］。陳昶洲等［23］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)四聯(lián)療法（鉍劑+PPI+兩種抗菌藥物）聯(lián)合黃芪顆粒能有效提高慢性胃炎伴消化不良患者的H.pylori根除率，且具有良好的安全性。王成喜等［24］發(fā)現(xiàn)，黃芪具有殺滅H.pylori、抗?jié)儭⒁种莆杆岱置诘茸饔?。ASIV為黃芪的主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化、調節(jié)機體免疫等功能。越來越多的實驗研究發(fā)現(xiàn)，ASIV有較好的抗菌作用，對大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌，甚至結核分枝桿菌的抑菌作用均有報道［25］。在本實驗中，我們通過考察ASIV對H.pylori定植相關因子（尿素酶活性、鞭毛動力、ureA、ureB、flaA、flaB、babA、sabA、alpA、alpB等定植相關基因）的影響，發(fā)現(xiàn)ASIV能消弱H.pylori的定植能力，且主要是通過抑制尿素酶的活性和下調尿素酶相關基因（ureA、ureB）mRNA水平來實現(xiàn)的。