多光譜法結(jié)合分子模擬技術研究多西他賽與人血清白蛋白的作用

霍彩霞， 何麗君， 石 雷， 狄 婧， 田淑麗

(1.蘭州城市學院化學化工學院，甘肅蘭州 730070 2.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州 730070)

多西他賽(Docetaxel，DT)在臨床上用于治療乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等癌癥，該藥主要是通過生物細胞內(nèi)的特殊調(diào)控抑制癌細胞的擴散，從而發(fā)揮特異性免疫作用[1,2]。作為紫杉醇的衍生藥物，DT的抗腫瘤活性優(yōu)于紫杉醇，但會對人的運動神經(jīng)、消化系統(tǒng)等表現(xiàn)出一定的毒副作用[3]。目前，多數(shù)藥物能夠達到治療效果的方式是藥物進入血液與蛋白結(jié)合形成配合物，經(jīng)血液運輸?shù)竭_人體患病處釋放藥物分子[4]。在藥物治療期間，通過水果及谷物攝入輔酶可以提高人體的抗氧化力和免疫力，但同時也會影響藥物的治療效果。有關DT的研究報道多見于高活性低毒性的多西紫杉醇劑型的開發(fā)[5,6]、治療機理及耐藥性的研究[7,8]、聯(lián)合藥物治療安全評價[9,10]等，對于DT和人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)相互作用的研究較少。

本文以DT和HSA作為研究對象，綜合利用熒光光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、圓二色譜法，并結(jié)合分子模擬對接技術，對DT與HSA的相互作用機理以及輔酶對DT-HSA體系的影響進行了詳細探究。從分子層面討論DT在人體內(nèi)的藥用機制，為用藥期間的臨床試驗和食品攝入提供有益信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度儀(日本，島津公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本，島津公司)，Nicolet Is 10傅里葉變換紅外光譜儀(美國，Thermo Nicolet公司)；Olis DSM 1000雙光束圓二色光譜儀(美國，OLIS DSM公司)。

人血清白蛋白(HSA,Sigma)儲備溶液：用pH=7.40 Tris-HCl緩沖溶液配成1.0×10-5mol·L-1；多西他賽(DT)儲備溶液：先加1滴丙酮溶解DT(純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司)，再用無水乙醇配成1.0×10-3mol·L-1。華法林(Warfarin,WF)和布洛芬(Ibuprofen,IBU)溶液的濃度均為2.0×10-3mol·L-1；輔酶Q10(CQ10)、輔酶A(CoA)、維生素B1(VB1)、維生素C(VC)、核黃素(VB2)、維生素E(VE) 及L-氧化型谷胱甘肽(GSH)溶液，濃度均為1.0×10-4mol·L-1；溶液于4 ℃避光保存。實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

實驗2:于1 cm比色皿中移入3.0 mL HSA溶液，設定λex=220～302 nm，逐次增加1 nm,在溫度為298 K下，掃描HSA的熒光光譜；再加入40 μL 1.0×10-3mol·L-1的DT溶液進行反應，測定DT-HSA的三維熒光光譜；扣除等量緩沖溶液與配體的熒光干擾。

實驗3:以pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液為參比，測定HSA、DT及摩爾比為1∶1 DT-HSA體系的傅里葉紅外光譜，對DT-HSA體系和DT的紅外光譜差減得到與DT作用后HSA的紅外光譜。用軟件Nicolet Omnic和Peakfit V4.12對與DT作用前后HSA的紅外光譜酰胺Ⅰ帶進行Gauss峰擬合、基線校正、去卷積以及二階導數(shù)處理。

實驗4:以Tris-HCl緩沖溶液為參比，池徑1 mm，掃描速度2.2 nm·s-1，掃描HSA與DT-HSA體系在200～280 nm波長范圍內(nèi)的圓二色譜，考察反應前后HSA中α-螺旋結(jié)構含量的變化情況。

實驗5:使用Schr?dinger 10.2和該軟件的Glide模塊分別進行人血清白蛋白與藥物的對接。先進行蛋白質(zhì)結(jié)構準備，包括加氫、對缺失的原子和殘基及l(fā)oop區(qū)進行修補等，進而產(chǎn)生格點，最后與配體分子進行對接。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅機理

圖1右上角為DT-Tris-HCl體系的熒光光譜曲線，在波長280 nm激發(fā)下，DT在310 nm處發(fā)射峰的熒光強度隨其濃度的增大而增強，同時對HSA在336 nm處的最大熒光特征峰強度也會產(chǎn)生影響，進行空白扣除。從圖1可看出，隨著DT濃度的增大，HSA的熒光發(fā)射峰強度有規(guī)律的降低，峰位發(fā)生明顯藍移，說明DT對HSA的內(nèi)源熒光具有猝滅作用。以Stern-Volmer方程[13]處理實驗溫度下DT對HSA的熒光猝滅數(shù)據(jù)，得到猝滅速率常數(shù)Kq和動態(tài)猝滅常數(shù)KSV(表1)。KSV隨著溫度的升高而減小，同時，Kq值遠大于小分子對HSA的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，可初步推斷DT對HSA熒光的猝滅機制為靜態(tài)猝滅。

圖1 溫度309 K下DT對HSA的熒光發(fā)射光譜(pH=7.40)Fig.1 Fluorescence emission spectra of HSA in the presence of DT at temperature 309 K(pH=7.40)λex=280 nm;cHSA=1.0 μmol·L-1,cDT(1-8)=0,3.3,6.6,9.9,13.1,16.4,19.7,22.9 μmol·L-1.

表1 DT-HSA體系的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和希爾系數(shù)

由DT-HSA體系的紫外光譜(圖2)可知，隨著藥物濃度增大，HSA在波長278 nm處的吸光度逐漸增強，峰位藍移4 nm，表明DT與HSA結(jié)合形成配合物[13,14]。差譜圖顯示，DT-HSA與DT的差譜曲線(a)和HSA吸收譜線并不重合，這進一步佐證DT與HSA的相互作用為靜態(tài)猝滅過程。

圖2 溫度309 K下DT-HSA體系的紫外吸收光譜(插圖為差譜圖)Fig.2 UV spectra of DT-HSA system at temperature 309 K(The inset corresponds to the absorption spectra of HSA and the difference spectra between HSA-DT and DT at the same concentration,cHSA=cDT=10.0 μmol·L-1)cHSA=10.0 μmol·L-1,cDT(1-8):0,3.3,6.6,9.9,13.1,16.4,19.7,22.9 μmol·L-1.

2.2 結(jié)合常數(shù)、作用力和結(jié)合距離

DT與HSA的靜態(tài)猝滅作用符合公式：lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q][4]，求得二者間的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n(表1)。Ka隨實驗溫度升高而減小，結(jié)合常數(shù)達到103數(shù)量級，n近似等于1，說明DT分子在HSA有一個結(jié)合位點，二者作用形成1∶1的配合物。依據(jù)實驗溫度下DT-HSA體系的熱力學參數(shù)平均值(ΔH=-29.30 kJ·mol-1,ΔS=-24.94 J·mol-1·k-1,ΔG=-21.66 kJ·mol-1)，結(jié)合Ross等[15]的研究可判斷，DT與HSA通過氫鍵和范德華力共同作用，二者的結(jié)合是一個放熱、熵減自發(fā)進行的反應。

根據(jù)F?rter的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移定理可以計算出DT與HSA的結(jié)合距離[13]。HSA熒光光譜與DT紫外光譜圖疊加部分的積分面積J=1.49×10-10cm3·L·mol-1，臨界距離R0=0.78 nm，DT與HSA的結(jié)合距離r=1.48 nm<7 nm，且R0

2.3 藥物協(xié)同性

Hill方程的希爾系數(shù)nH可以用來分析配體分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的協(xié)同性作用。根據(jù)文獻報道[16]求得實驗溫度下的nH(表1)，由nH的平均值約等于1可知，DT分子與HSA中Tyr與Trp殘基的結(jié)合對后繼配體和蛋白質(zhì)的結(jié)合影響不大，即無藥物協(xié)同作用。

2.4 結(jié)合位點的確定

首先通過比較激發(fā)波長在280 nm(同時激發(fā)Trp和Tyr殘基的熒光)和295 nm(只激發(fā)Trp殘基的熒光)時HSA的熒光猝滅程度，確定藥物與蛋白結(jié)合的具體位置[17]。在溫度309 K，對DT-HSA體系在λex/λem=280/336 nm和295/336 nm處的熒光強度進行F/F0～cDT/cHSA線性擬合，得到方程斜率k280=-0.0083 和k295=-0.0051，說明DT對HSA的猝滅曲線沒有重疊，且280 nm激發(fā)時降低程度更大，表明Trp和Tyr殘基均參與反應，DT在HSA中的結(jié)合位點主要處于亞螺旋域ⅡA。

另設定熒光探針華法林/布洛芬與HSA的濃度比為1∶15時測定DT-HSA體系的熒光強度。結(jié)果表明，溫度309 K下，三元體系WF-DT-HSA和IBU-DT-HSA的Ka與DT-HSA(4.19×103L·mol-1)相比，Ka(WF-DT-HSA)(24.5 L·mol-1)減小，Ka(IBU-DT-HSA)(1.93×104L·mol-1)增大，但華法林對Ka值的影響明顯大于布洛芬，說明華法林與DT共用同一個結(jié)合位點ⅡA siteⅠ[12]。

2.5 DT對HSA構象的影響

2.5.1 同步熒光測定同步熒光光譜根據(jù)熒光發(fā)色團的最大發(fā)射波長處微環(huán)境的變化信息可以判斷蛋白質(zhì)的構象變化[12,13]。固定HSA濃度，增加DT含量，Δλ=15 nm時HSA中酪氨酸殘基的熒光猝滅程度較小(KSV=2.20×102L·mol-1)，峰位不變；Δλ=60 nm時色氨酸殘基最大峰的熒光強度顯著降低(KSV=1.16×104L·mol-1)，且略有藍移。這說明DT與HSA的結(jié)合位點更偏向色氨酸殘基。

2.5.2 三維熒光光譜通過三維熒光光譜等高圖，建立HSA及DT-HSA體系完整信息的指紋圖譜(圖3)。峰1是HSA中肽鏈羰基骨架的特征峰，峰2反映HSA的生色團Trp和Tyr殘基的光譜特性[18]。峰1峰頂坐標(λex/em,F)=(234/334,288.141)，峰2峰頂坐標(λex/em,F)=(283/336,421.031)。加入DT后，HSA的熒光峰峰1(234/328,184.648)藍移6 nm，峰2(283/334,371.381)藍移2 nm，其熒光強度分別降低了35.92%和11.79%。說明Trp和Tyr殘基所處微環(huán)境的極性減弱，疏水性增強，構象發(fā)生了變化。

圖3 HSA、DT-HSA的三維熒光等高線圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence contours of HSA and DT-HSA cHSA=1.0 μmol·L-1,cDT=13.1 μmol·L-1

2.5.3 傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜分析蛋白質(zhì)在紅外區(qū)的特征吸收帶主要有蛋白質(zhì)骨架C=O伸縮振動引起的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)及包含C-N伸縮和N-H彎曲振動耦合信息的酰胺Ⅱ帶[19]。FT-IR差譜圖(圖4a)顯示，在加入DT后，HSA的特征峰強度降低，酰胺I帶由1 640 cm-1移至1 572 cm-1，O-H伸縮振動峰移動相對微弱，這可能是由于DT和HSA分子間的C=O、O-H基團相互作用形成較強的分子間氫鍵[20]，破壞了HSA中維系原有二級結(jié)構穩(wěn)定性的氫鍵，同時表明DT與HSA形成配合物中存在氫鍵。

酰胺Ⅰ帶包含不同的二級結(jié)構信息，對蛋白質(zhì)研究更有價值。通過對酰胺Ⅰ帶的多次擬合(圖4b和4c)確定各子峰與不同二級結(jié)構的對應關系，可根據(jù)積分面積得到β-折疊(1 610～1 637 cm-1)、無規(guī)則卷曲(1 638～1 649 cm-1)、α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 680 cm-1)和反β-折疊(1 680～1 700 cm-1)等HSA二級結(jié)構的含量。藥物DT與HSA作用后，β-折疊和α-螺旋含量分別由25.95%和41.88%下降至15.42%和27.37%，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及反β-折疊含量分別由14.53%、10.43%、7.21%增加到22.27%、23.64%和11.30%，而且總增加量和總降低程度基本相同。說明HSA與藥物作用后，其二級結(jié)構在內(nèi)部發(fā)生轉(zhuǎn)化，對其構象產(chǎn)生了影響。

圖4 紅外(IR)差譜圖和酰胺Ⅰ帶高斯擬合圖Fig.4 IR difference spectrum and Gauss fitting graph of amide Ⅰ of HSA and DT-HSA system

2.5.4 圓二色(CD)譜法驗證HSA構象變化通過分析CD圖進一步證實了DT對HSA主鏈構象的影響[18]。從圖5可知，在208和217 nm處出現(xiàn)兩個負的特征肩峰，這是HSA中α-螺旋結(jié)構的特征峰。隨著與DT反應，特征峰強度升高，α-螺旋的含量由39.49%降至24.78%。說明DT通過與蛋白質(zhì)主肽鍵結(jié)合，維持α-螺旋結(jié)構的氫鍵作用減弱，變?yōu)樯煺沟亩嚯?，導致HSA的構象發(fā)生改變。

圖5 DT-HSA體系的圓二色譜圖Fig.5 CD spectra of DT-HSA

2.6 分子對接

通過分子模擬技術可以更直觀的了解藥物與HSA的結(jié)合位點和作用力類型。從圖6a和6b可看到，HSA有足夠空間與DT分子相互作用，藥物小分子周圍的疏水性殘基Ala291、Leu(238,219)和Trp214與DT中的甲基存在微弱的疏水作用，帶正電荷的His440、Arg(222,218)、Lys(444,195)殘基與DT分子中帶有孤對電子的羰基氧和苯環(huán)形成較強的范德華力；Pro447、Cys448、His440、Glu(188,294,292)和Asp451與小分子間存在氫鍵。

圖6c展示分子靜電表面，用藍色、紅色和白色代表正電荷、負電荷和中性殘基，分析發(fā)現(xiàn)DT分子周圍中性殘基較多，靜電作用存在的可能性較小。DT分子距離Trp214較Tyr452近，說明DT主要猝滅的是HSA中色氨酸的內(nèi)源熒光，這與前文結(jié)論一致，也是對作用力研究的驗證和補充。

圖6 DT與HSA相互作用的分子模擬Fig.6 Molecular simulation of interaction between DT and HSAa.Molecular docking simulation and 3D diagram;b.Interaction 2D map;c.Electrostatic surface map.

2.7 輔酶對HSA及DT-HSA體系的影響

固定HSA與輔酶的濃度比為3∶1，加入不同濃度DT溶液，測定輔酶-HSA和輔酶-DT-HSA體系λex/λem=280/336 nm處的熒光強度，以探究輔酶對HSA及DT-HSA體系的影響。DT對HSA的熒光猝滅效率Q=[(F0-F)/F0]×100%，結(jié)果顯示，當輔酶單獨存在時，對HSA存在較強的熒光猝滅作用，其猝滅程度表現(xiàn)為VB2>CoA>VC>VE>VB1>GSH>CQ10，見表2。

表2 輔酶對DT與HSA相互作用的影響

分析表2中數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)輔酶-DT-HSA三元體系的動態(tài)猝滅常數(shù)Kq值數(shù)量級仍為1012，遠大于最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，說明輔酶的存在對猝滅機制沒有影響，仍為靜態(tài)猝滅；但三元體系的Ka和n都減小，其中VB2影響最大。輔酶對HSA的熒光猝滅效率Q越大，對DT與HSA的結(jié)合影響越大，7種輔酶對DT-HSA體系的影響與對HSA熒光猝滅程度的影響表現(xiàn)一致。表明輔酶優(yōu)先占據(jù)結(jié)合位點，極大降低了DT與HSA的結(jié)合，縮短了DT在人體內(nèi)的停留時間?？梢姡o酶在人體中與藥物競爭結(jié)合，由此影響藥物的療效?；颊咴谟盟幤陂g應當合理安排膳食，以增強機體免疫力，在確保治療效果的同時降低藥物的副作用。

3 結(jié)論

在模擬生理條件下，DT與HSA的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而降低，結(jié)合紫外光譜證實，DT對HSA內(nèi)源性熒光的猝滅作用為靜態(tài)猝滅，用靜態(tài)猝滅雙對數(shù)公式計算得到DT與HSA的結(jié)合位點數(shù)n約等于1。DT-HSA的熱力學參數(shù)ΔH和ΔS均小于零，表明氫鍵和范德華力對維持配合物(1∶1)穩(wěn)定性起重要作用，用分子對接技術進行驗證并補充，二者間也存在微弱的疏水力。DT與HSA的結(jié)合距離r約為1.48 nm，其主要結(jié)合位點位于HSA的亞結(jié)構域ⅡA site Ⅰ。nH≈1表明在HSA的結(jié)合位點處，藥物分子間幾乎不存在協(xié)同效應。

同步熒光光譜、三維熒光光譜、紅外光譜和圓二色譜表明，DT使HSA中Trp殘基微環(huán)境極性減弱，α-螺旋結(jié)構含量減小，構象發(fā)生改變。輔酶與DT形成競爭，對DT與HSA的結(jié)合有抑制作用，但不影響其猝滅機制。