超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜快速篩查蔬菜中18種農藥殘留

林守二， 楊麗娟， 鄭仁錦， 黃麗英*

(1.福建醫(yī)科大學藥學院，福建福州 350122；2.福建省疾病預防控制中心，福建福州 350001)

蔬菜與人們生活息息相關，其在栽培過程需要噴灑農藥預防蟲病危害。近年來，農藥殘留問題已成為影響蔬菜質量安全的一個重要因素[1 - 3]。多菌靈、甲基硫菌靈、甲霜靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉、三唑酮、戊唑醇、丙環(huán)唑、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑為殺菌劑，在全球的農藥市場中，殺菌劑的市場份額占比較大[4]；吡蟲啉、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威為殺蟲劑，為煙堿類農藥，通過與害蟲體內尼古丁乙酰膽堿受體結合而將其殺死，但與人和動物體內該受體也會結合而造成危害[5]；6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、多效唑、烯效唑為植物生長調節(jié)劑，是一類與植物內源激素具有相似生理功效的人工合成物，使用后可使蔬果產量增加，但過量使用對人體有明顯的慢性毒性[6]。這三類共18種農藥皆為蔬菜中的常用農藥，且在國家食品安全風險監(jiān)測中檢出率較高，因此，建立合適方法同時快速篩查并規(guī)范他們的使用具有重要意義。

蔬菜中農藥殘留的前處理方法有很多，而QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)法被廣泛用于農藥殘留的前處理[7 - 9]。農藥殘留的檢測方法主要有電化學法[10]、液相色譜法[11,12]、免疫分析法[13]、生物傳感器法[14]、毛細管電泳-串聯質譜法[15]、氣-質聯用法[16 - 18]、液相色譜-三重四極桿-質譜法[19 - 21]、超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrpole-Time of Flight Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF MS)[22 - 24]等。其中UPLC-Q-TOF MS為高分辨質譜，可精確測定多組分目標化合物分子量，比其它方法在確證分析中具有更大優(yōu)勢。目前Q-TOF MS在農藥多殘留篩查中多使用一些通用數據庫作分析[25]，但其保留時間受實驗室實際分析條件限制無法作為定性依據，而應用自建的數據庫不僅可根據母離子精確分子量及二級碎片離子相匹配，且可利用保留時間加以定性，具有基質干擾小、定性準確度高等優(yōu)點。

本實驗利用UPLC-Q-TOF MS法結合QuEChERS前處理技術，優(yōu)化前處理條件及檢測條件，選用1%乙酸乙腈提取，QuEChERS法(MgSO4+C18)凈化，自建譜庫篩查蔬菜中的常用農藥，包括殺菌劑、殺蟲劑以及植物生長調節(jié)劑三類共18種農藥的殘留。通過精確質量數、保留時間以及二級碎片離子信息匹配，且所建譜庫可用于再次檢測的無標準溶液直接定性，具有簡單、快速、準確的優(yōu)勢，可用于蔬菜中多農藥殘留的快速篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6545超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用儀，配有Dual AJS ESI源(美國，Agilent公司)；BSA124S分析天平(德國，Sartorius公司)；Multi Reax自動渦旋混合器(德國，Heidolph公司)；Allegra X-30離心機(美國，Beckman Coulter公司)。

18種農藥標準品：多菌靈、吡蟲啉、啶蟲脒、6-芐氨基嘌呤、甲基硫菌靈、甲霜靈、抗倒酯、氯蟲苯甲酰胺、嘧霉胺、烯酰嗎啉、多效唑、三唑酮、烯效唑、戊唑醇、丙環(huán)唑、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、茚蟲威，純度均大于98%，均購于北京迪馬科技有限公司。脫水試劑包(內含6 g無水MgSO4和1.5 g NaAc)，QuEChERS試劑包(內含150 mg MgSO4，25 mg C18，德國CNW公司)。甲酸(色譜純，德國CNW公司)，乙酸(色譜純，德國CNW公司)，甲酸銨(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，無水MgSO4(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

蔬菜樣品采集于福州的超市及農貿市場，所有樣品取可食部份勻漿后，于-18 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制分別準確稱取18種農藥標準品10.00 mg，用乙腈配制成1.0 mg/mL的標準儲備溶液，然后分別稀釋得18種農藥為10 μg/mL的標準儲備溶液。用各個標準儲備溶液制得含18種農藥500 μg/L的混合操作溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品提取稱取5.000 g經勻漿后的蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入10.00 mL 1%乙酸乙腈，渦旋振蕩2 min，于4 ℃冰箱中放置15 min后，加入脫水試劑包，迅速搖勻，渦旋振蕩1 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液1.00 mL加入至含QuEChERS試劑包管內，渦旋后離心5 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜后，待測定。若遇組分峰面積超出線性范圍，則需要根據超出情況用空白基質溶液稀釋至合適濃度后進行測定。

1.3 UPLC與MS/MS檢測條件

1.3.1 UPLC條件Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；流動相A為含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～6 min，10%～30%B；6～20 min，30%～80%B；20～26 min，80%～95%B；26～30 min，95%～95%B。流速：0.25 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 MS/MS條件電噴霧離子源(ESI)；正離子(ESI+)掃描；掃描范圍m/z50～1100。干燥氣溫度：280 ℃；干燥氣流速：8 L/min；毛細管電壓：4 000 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；Fragmentor：120 V；參比離子為m/z121.0509/922.0098，用于實時校正；MS及MS/MS模式下采集質譜數據。

1.3.3 譜庫的建立18種農藥的分子式、精確質量數、母離子及保留時間等信息見表1。

表1 18種農藥的分子式、精確質量數、母離子、特征碎片離子和保留時間

(續(xù)表1)

在系統(tǒng)自帶的PCDL軟件中輸入目標組分的名稱、CAS號、分子式，自動生成精確分子量，為一級譜庫。在全掃描模式下對18種農藥的混合標準溶液按儀器的檢測條件進行檢測，并通過Find by formula匹配到一級譜庫，更新各組分的保留時間。

在已建立的一級譜庫的基礎上，將所得化合物的母離子及保留時間導入到Targeted MS/MS的Target list的列表，設置三個不同碰撞能量，設置碎片離子掃描范圍為m/z50～1100，得到不同碰撞能量下碎片離子的質譜圖，添加到PCDL的一級譜庫中，即建成18種目標化合物的二級譜庫。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1 前處理條件的選擇實驗中發(fā)現，提取溶劑選用乙酸-乙腈(1∶99，V/V)時，各組分提取效率均較高。在使用QuEChERS法凈化時，試劑包中的無水MgSO4常作為脫水試劑，N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)和石墨化碳黑(GCB)常作為吸附劑。其中PSA一般用于去除樣品中的碳水化合物，C18主要用于吸附脂肪和酯類等非極性物質，而GCB則用于吸附色素。本實驗研究發(fā)現，當凈化劑中加入PSA，6-芐基腺嘌呤回收率降低(降至70%以下)；而加入GCB時，具有平面π-π結構的多菌靈和嘧霉胺的回收率均明顯下降。18種農藥中多菌靈是一種苯并吡唑類農藥，極性較小，C18的加入雖然使其回收率有所下降，但在不同基質中的加標回收均大于79%，因此認為C18可作為凈化劑的備選。選取空白基質混合溶液作為樣品基質，加與不加C18時的總離子流色譜圖中，色譜基線差異不明顯；在目標組分響應上，加入C18后，多菌靈響應略微下降，但響應本就比較低的抗倒酯、烯酰嗎啉和多效唑響應值均上升，其他組分響應影響不明顯。綜合考慮需要加入C18作為凈化劑。因此，最終選用1%乙酸乙腈提取，QuEChERS法(MgSO4+C18)凈化。依據本課題組先前研究以及文獻中對于凈化劑常用量的考察[26 - 28]，選用QuEChERS試劑包(內含150 mg MgSO4，25 mg C18)。

2.1.2 檢測條件的選擇甲醇-水、乙腈-水常作為液-質分析的流動相，實驗發(fā)現用乙腈-水作為流動相時，體系壓力較低，且水相中加入含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨溶液后目標組分的峰形較佳，因此液相條件使用乙腈與含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨溶液梯度洗脫。在每次實驗前，均需對儀器調諧校正。設置預碰撞解離電壓分別為80、120和150 V，比較各組分的響應值，最終選擇各組分響應均較高的120 V。

2.1.3 定性篩查與確證在實際樣品分析中，采用MS結合碰撞能量的模式掃描采集數據，根據“1.3.3”建立的篩查譜庫，18種農藥化合物均能被準確確證。提取離子色譜圖(EIC)見圖1。

圖1 18種農藥的提取離子色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatogram of 18 pesticides1.Carbendazim；2.Imidacloprid；3.Acetamiprid；4.6-Benzyladenine；5.Thiophanate-methyl；6.Metalaxyl；7.Trinexapac-ethyl；8.Chlorantraniliprole；9.Pyrimethanil；10.Dimethomorph；11.Paclobutrazol；12.Triadimefon；13.Uniconazole；14.Tebuconazole；15.Propiconazole；16.Prochloraz；17.Difenoconazole；18.Indoxacarb.

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限18種農藥均采用基質匹配外標法定量分析，以空白基質配制混合標準溶液，以濃度(X,μg/L)為橫坐標，定量離子峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸計算。以3倍信噪比(S/N≥3)計算檢出限(LOD)，以10倍的信噪比(S/N≥10)計算定量限(LOQ)。18種農藥的線性范圍、回歸方程、LOD、LOQ見表2。相關系數(r)均大于0.9908，線性良好，檢出限在0.0006～0.005 mg/kg之間，定量限在0.002～0.016 mg/kg之間。

表2 18種農藥組分的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.2.2 準確度及精密度分別選擇不含目標化合物的豆芽、白菜和黃瓜空白樣品，加入低、中、高3個水平的農藥混合標準溶液，使得多菌靈、6-芐氨基嘌呤、甲基硫菌靈、甲霜靈、抗倒酯、嘧霉胺、烯酰嗎啉、多效唑、三唑酮、烯效唑、戊唑醇、丙環(huán)唑、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、茚蟲威終濃度為5、10、50 μg/kg，吡蟲啉、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺終濃度為10、50、100 μg/kg，按“1.2.2”樣品處理步驟前處理，優(yōu)化儀器檢測條件下檢測，每個濃度水平平行測量6次，測得18種農藥組分的平均回收率為73.56%～103.2%，相對標準偏差(RSDs)為0.23%～9.85%，結果見表3。

表3 18種農殘組分在不同基質中3個加標水平下加標回收率及相對標準偏差(n=6)

(續(xù)表3)

2.3 實際樣品的確證與定量

實際樣品按照前處理步驟和優(yōu)化檢測條件，使用Q-TOF的MS/MS模式，設置碰撞能量分別為0、10、30 eV采集數據，同時得到化合物的一級母離子的信息以及在設定碰撞能量下的二級碎片離子信息，用所建譜庫篩查目標化合物，根據歐盟2002/657/EC決議，使用高分辨質譜作為確證技術時，檢測到1個具有精確質量數的母離子、保留時間匹配、且二級質譜中的至少1個子離子匹配即可確證該化合物。

采用本實驗建立的方法對市售60種蔬菜樣品進行快速檢測，根據我國國家標準(GB 2763-2019)[29]《食品中農藥最大殘留限量值》，沒有具體規(guī)定的食品種類按限量值≤1 mg/kg計算，所得各組分的檢出值范圍在0.0021～4.38 mg/kg之間，總檢出率為71.67%，總合格率為93.33%，具體結果見表4。其中超標的為菠菜(三唑酮1.02 mg/kg)，上海青(烯酰嗎啉1.15 mg/kg)，茼蒿(丙環(huán)唑4.38 mg/kg)，香菜(丙環(huán)唑4.05 mg/kg)各1份。結果表明，市售蔬菜農藥殘留總體控制較佳，但依然有超標情況的出現，持續(xù)監(jiān)測仍有必要。

表4 實際樣品的檢測結果

3 結論

本實驗以1%乙酸乙腈提取蔬菜中的18種農藥殘留，并優(yōu)化選擇以MgSO4+C18作為QuEChERS凈化劑凈化樣品提取液，通過調試質譜參數和色譜條件，建立18種農藥的一級精確質量數據庫以及二級譜圖庫，采用UPLC-Q-TOF MS方法同時快速篩查28種蔬菜中18種農藥殘留。QuEChERS前處理方法操作簡便、試劑消耗量小、凈化效果好，而UPLC-Q-TOF MS為高分辨質譜，基質干擾小、定性準確度高，為蔬菜中多殘留農藥的持續(xù)監(jiān)測提供方法參考。本實驗所篩查農藥種類為18種常用農藥，有希望繼續(xù)使用自建譜庫的方法一次篩查更多種類的農藥，爭取完成農藥多殘留的無標準品快速篩查。