一株血鸚鵡遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

徐赟霞　王禹　韓進剛　陳浩楠　馮守明

摘要：為確定天津市某養(yǎng)殖場血鸚鵡（Cichlasoma var.）發(fā)病死亡的原因，并對其進行有效的預(yù)防與治療，本試驗對患病的血鸚鵡進行病原的分離鑒定、回歸感染及藥敏試驗。從病灶處分離出一株疑似病原菌命名為XYW-1，經(jīng)人工感染后具有致病性，臨床癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，半致死濃度為4.75×10 5 CFU/mL;經(jīng)生化鑒定和16S rDNA序列分析，XYW-1為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）;以18種抗生素對遲緩愛德華氏菌進行了藥物敏感性測定，結(jié)果顯示遲緩愛德華氏菌僅對頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素7種藥物敏感。

關(guān)鍵詞：血鸚鵡（Cichlasoma var.）;遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）;分離鑒定;藥敏試驗

遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）為腸桿菌科愛德華菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，無莢膜，也不形成芽孢，廣泛存在于溪水、湖泊和海洋等水環(huán)境中，能感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類甚至哺乳類動物[1-2]，遲緩愛德華氏菌是愛德華氏菌屬中唯一能夠感染人的致病菌，它能引起人的腸胃炎、腹瀉等，較嚴(yán)重的還可以引起腦膜炎和敗血癥等疾病[3]。近年來遲緩愛德華氏菌對魚類健康的危害越來越嚴(yán)重，研究者們在斑馬魚[1]、大菱鲆[4]、斑點叉尾鮰、鯉魚、日本鰻鱺、尼羅羅非魚、漠斑牙鲆[5]、鱖魚[6]、雜交鱧[7]、黃鱔[8]等中都發(fā)現(xiàn)有遲緩愛德華氏菌感染。

血鸚鵡（Cichlasoma var.）又名紅財神、發(fā)財魚和財神魚，屬于淡水熱帶觀賞魚，由于其顏色鮮艷，形態(tài)可愛、抗病力強，對溫度適應(yīng)能力強等特點深受天津市市民喜愛，成為天津地區(qū)主要觀賞魚養(yǎng)殖品種。但是隨著養(yǎng)殖密度的不斷提高，病害也逐年增加，給養(yǎng)殖戶造成經(jīng)濟損失，有報道血鸚鵡感染嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌[9-10]等，但至今尚未見有血鸚鵡感染遲緩愛德華氏菌的報道。本研究通過對患病血鸚鵡進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，以期能夠找出血鸚鵡發(fā)病原因并提供用藥指導(dǎo)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中防治遲緩愛德華菌病提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

患病的和健康的血鸚鵡均來自天津市寶坻區(qū)某觀賞魚養(yǎng)殖場，腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（MH）、藥敏紙片均購自O(shè)xoid公司;VITEK GN鑒定卡購自法國梅里埃生化公司;PCR所用的試劑購于普洛麥格（Promega）生物技術(shù)有限公司。

1.2病原菌的分離與純化

在無菌條件下，從患病的血鸚鵡肝臟、脾臟、腎臟中取樣，劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)24 h后，選擇從腎臟中分離的優(yōu)勢菌落，在營養(yǎng)瓊脂上劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)的菌株，轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)瓊脂斜面上，備用。

1.3人工感染試驗

將健康的鸚鵡魚（體長8.76 cm±0.64 cm，體重47.21 g±2.67 g）暫養(yǎng)1周，水溫保持在27～28 ℃，無異常情況后進行人工感染試驗。將50尾健康的鸚鵡魚平均分成5組，將XYW-1菌株用生理鹽水洗脫分別制成3×108、3×107、3×106、3×105 CFU/mL的菌懸液，取以上4個濃度的菌懸液，按照0.1 mL/尾的劑量用無菌注射器對血鸚鵡進行腹腔注射，對照組注射0.1 mL的生理鹽水，持續(xù)觀察5 d，并記錄好死亡情況，對患病的血鸚鵡進行病原菌的分離鑒定，根據(jù)寇氏法[11]計算半致死劑量。

1.4生理生化鑒定

將病原菌接種在營養(yǎng)瓊脂上，對其進行革蘭氏染色，鏡下觀察其形態(tài)特征。在無菌條件下挑取單個菌落制成菌懸液，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)和VITEK GN鑒定卡對其進行生理生化特性測定。

1.516S rDNA基因序列鑒定及發(fā)育樹構(gòu)建

挑取單個菌落于30 μL去離子水中，100 ℃金屬浴10 min后，12 000 r/min離心1 min后取上清作為PCR模板。16S rRNA序列擴增引物27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1 492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送金唯智生物科技（天津）有限公司測序。測序結(jié)果通過NCBI中BLAST檢索系統(tǒng)進行在線比對，選取與其同屬的細菌16S rDNA基因序列，用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析（Bootstraping）進行系統(tǒng)進化樹的評估自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.6藥敏試驗

將菌株用生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛?，用無菌的棉拭子蘸取稀釋好的菌懸液均勻涂布于MH平板上，待平板表面干燥后，用鑷子將藥敏紙片輕輕放置在平板表面并壓緊，放置在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后用直尺量取抑菌圈直徑，試驗結(jié)果判斷參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[12]。

2結(jié)果

2.1臨床癥狀及病原菌形態(tài)特征

患病的血鸚鵡主要表現(xiàn)為體表出血、潰爛，鱗片脫落，胸鰭基部腫脹，剖開魚腹，病魚肝臟、腎臟明顯腫大，脾臟失血呈粉紅色。從腎臟中分離獲得的優(yōu)勢菌株XYW-1為革蘭氏陰性短桿菌，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落為正圓形、灰白色、表面濕潤、邊緣整齊、凸起。

2.2人工感染試驗結(jié)果

經(jīng)人工感染發(fā)病血鸚鵡的主要臨床癥狀與自然感染菌株的癥狀相似，其體表出血，鰓絲充血、有明顯的潰爛。從死亡的血鸚鵡的腎臟中分離到的菌株經(jīng)鑒定后與XYW-1一致，而注射無菌生理鹽水的對照組無死亡現(xiàn)象，外觀特征無明顯變化，由此可以說明菌株XYW-1是引起血鸚鵡發(fā)病死亡的病原菌。根據(jù)寇氏法計算可知菌株對血鸚鵡的半致死劑量為4.75×105 CFU/mL（表1）。

2.3病原菌的生化特征

使用VITEK GN鑒定卡對其進行生理生化鑒定，生理生化反應(yīng)見表2。XYW-1符合遲緩愛德華氏菌生理生化特性，結(jié)合細菌形態(tài)和生理生化結(jié)果可初步判定分離菌XYW-1為遲緩愛德華氏菌。

2.416S rDNA基因序列分析結(jié)果

病原菌XYW-1所擴增的16SrDNA基因序列長度為1 389 bp，以 NCBI 的 Blast 檢索系統(tǒng)對其進行序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，XYW-1與愛德華氏菌屬自然聚類，并與檢索出的遲緩愛德華氏菌聚為一支，同源性高達99%以上。綜合生理生化鑒定結(jié)果和16S rDNA基因序列分析結(jié)果，確定菌株XYW-1為遲緩愛德華氏菌。

2.5藥敏試驗結(jié)果

從表3可以看出，菌株XYW-1對頭孢類的頭孢噻肟、頭孢吡肟，內(nèi)酰胺類的阿莫西林、氨曲南，四環(huán)素類的多西環(huán)素和氯霉素類的氟苯尼考、氯霉素敏感;對頭孢呋辛、鏈霉素、新霉素和利福平中度敏感;而對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、阿奇霉素、紅霉素、四環(huán)素和磺胺甲惡唑耐藥。

3討論

近年來，國內(nèi)學(xué)者關(guān)于血鸚鵡細菌性疾病也有相關(guān)報道： 錢曉宇等[9]發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌感染血鸚鵡，臨床表現(xiàn)為體表出血，腹部腫大，鰓絲充血腫脹，肝臟腫大糜爛。梁利國等[10]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌感染血鸚鵡后，病魚眼球腫大、突出，眼瞼呈潰爛狀，肝臟呈黑紅色，膽囊腫大。本研究中對天津某觀賞魚養(yǎng)殖場病死的血鸚鵡進行了較系統(tǒng)的病原研究，從發(fā)病血鸚鵡腎臟分離到優(yōu)勢菌并作分離純化培養(yǎng)，人工感染試驗證實分離菌能引起健康血鸚鵡發(fā)病與死亡，再分離的細菌經(jīng)細菌學(xué)鑒定為同源感染菌，經(jīng)生物學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，分離菌為遲緩愛德華氏菌。這也是首次在血鸚鵡中分離到遲緩愛德華氏菌。

在天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)生細菌性疾病的時候大多仍采用抗菌藥物來控制其發(fā)生和流行，有效合理地應(yīng)用抗生素是防治魚類細菌性疾病的重要措施之一。魚類遲緩愛德華菌病具有流行范圍廣、發(fā)病率和病死率高等特點[13]，目前已有20多種魚類可感染遲緩愛德華氏菌并致病?？咕幬锏膹V泛使用，導(dǎo)致其對多數(shù)抗生素產(chǎn)生耐藥性，本試驗中以18種抗生素對遲緩愛德華氏菌進行了藥物敏感性測定，結(jié)果顯示遲緩愛德華氏菌僅對頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素7種藥物敏感，對其他藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥，出現(xiàn)這種情況究其原因多半與濫用抗生素有關(guān)，另外觀賞魚在防治病害時，不需要考慮藥物殘留的因素，對抗菌藥物使用劑量和使用頻率問題也沒有限制，也是造成XYW-1對抗菌藥物敏感性低的原因。本研究試驗結(jié)果可作為由該菌引起的血鸚鵡疾病防治選藥時的參考，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中可以使用頭孢噻肟、多西環(huán)素等高敏感藥物進行治療。

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Isolation， identification and drug sensitivity test of a strain of Edwardsiella tardata from Cichlasoma var.

XU Yunxia， WANG Yu， Han Jingang ，Chen Haonan，F(xiàn)ENG Shouming

（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402，China）

Abstract：In order to determine the causes of the disease and death of Cichlasoma var.in Tianjin， and to effectively prevent and treat them， the pathogen isolation and identification， regression infection and drug sensitivity tests were carried out on Cichlasoma var.in this study.A pathogenic bacteria named XYW-1 was isolated from the affected Cichlasoma var.， the artificial infection was pathogenic， and produced the similar clinical symptoms in artificially infected Cichlasoma var.as the naturally infected cases， and LCD was 4.75×105 CFU/mL. By physiological and biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis， XYW-1 was Edwardsiella tarda. In this experiment， 18 antibiotics were used to test the drug sensitivity of Edwardsiella tarda，and the results showed that Edwardsiella tarda was only sensitive to 7 of them， including cefotaxime， cefepime， amoxicillin， amtronam， doxycycline， florfenicol and chloramphenicol.

Key words：Cichlasoma var.; Edwardsiella tarda; isolation and identification; drug sensitivity test

（收稿日期：2021-05-08）