小球藻Chlorella sp. MEM25的分離鑒定及耐受性試驗(yàn)

盧香凝, 鄭 行, 路延篤

(1.福清市新大澤螺旋藻有限公司,福建 福州 350300；2.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南 ?？?570228)

小球藻是綠藻門Chlorophyta、小球藻屬Chlorella中的一種單細(xì)胞藻類,細(xì)胞直徑約3～8 μm,需要在顯微鏡下才能分辨[1].它的光合效率高、固定碳氮能力強(qiáng)、代謝途徑豐富,富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、維生素、色素等多種生物活性物質(zhì),在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值[2-5].目前,微藻的生物質(zhì)可以達(dá)到10萬(wàn) t干重的年產(chǎn)量和超過(guò)30億美元的年產(chǎn)值,其中小球藻約占30%的份額,且呈逐年上漲的趨勢(shì)[6].由此可見,小球藻的規(guī)模生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)開發(fā)具有十分廣闊的前景和市場(chǎng).然而在當(dāng)前的微藻規(guī)?；B(yǎng)殖過(guò)程中存在著一些亟待解決的問題,比如藻種耐受能力差、易產(chǎn)生雜藻污染、細(xì)胞濃度低、產(chǎn)量不穩(wěn)定等[7-10].

微藻的規(guī)?；B(yǎng)殖主要受生產(chǎn)地的環(huán)境條件影響,影響因子主要包括(1)溫度：大多數(shù)微藻的最佳生長(zhǎng)條件是20～25 ℃,然而不同地域之間具有較大的溫差.相較于我國(guó)北方地區(qū)而言,在我國(guó)南方地區(qū),如海南島的年均氣溫在22～27 ℃,夏季最高溫時(shí)可達(dá)40 ℃,過(guò)高的溫度會(huì)使微藻減產(chǎn),嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致絕收[11].(2)光照：光強(qiáng)是制約光合作用效率最關(guān)鍵的環(huán)境因子.在當(dāng)前常見的規(guī)模養(yǎng)殖微藻種類中,如微擬球藻的最適光照強(qiáng)度為50～100 μmol·m-2·s-1,但是我國(guó)南方地區(qū)的太陽(yáng)高度角較大,獲得的太陽(yáng)輻射較高,夏季的平均光照強(qiáng)度達(dá)500 μmol·m-2·s-1,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了光合作用可利用的水平,過(guò)量的光照會(huì)對(duì)微藻的光系統(tǒng)造成傷害,抑制光合作用,降低光合效率[12].(3)污染：微藻在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)微生物污染是當(dāng)前急需解決的重要問題之一,比如在試驗(yàn)室條件下出現(xiàn)細(xì)菌或真菌污染會(huì)危及藻種的保藏,特別是稀有物種和重要的突變體；在規(guī)模養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)菌和真菌感染,會(huì)由于菌落數(shù)過(guò)高而大大降低產(chǎn)品質(zhì)量,甚至使產(chǎn)品不達(dá)標(biāo)[13].研究表明[14]，通過(guò)提高培養(yǎng)基鹽度可以在一定程度上減少污染,然而對(duì)于相當(dāng)一部分微藻而言,鹽度的提高往往導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的下降.因此篩選并鑒定出對(duì)溫度、光照和鹽度具有寬幅適應(yīng)范圍且適應(yīng)于生產(chǎn)應(yīng)用的微藻種質(zhì)資源,是實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中最基礎(chǔ)也是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié),對(duì)于推動(dòng)微藻生物技術(shù)的理論研究和現(xiàn)實(shí)應(yīng)用具備重要的意義.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小球藻Chlorellasp. MEM25從海南鹽堿地區(qū)采集的鹽鹵水樣品中分離獲得；試驗(yàn)中對(duì)照組的微擬球藻NannochloropsisoceanicaIMET1取自于本實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù).

1.2 藻種的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察

采用梯度稀釋法對(duì)藻種進(jìn)行分離,將采集的鹽鹵水樣品取15 mL進(jìn)行離心收集,去掉上清液,取底層50 μL樣品涂布于固體F2培養(yǎng)基,在25 ℃條件下培養(yǎng)2周后挑取綠色克隆,將其劃線接種于F2平板倒置培養(yǎng)3周,重復(fù)3次獲得純化后的MEM25.在F2固體培養(yǎng)基上純化獲得MEM25后,直接觀察該藻的群落特征；挑取純化后的藻種群落,置于F2液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周,取藻液觀察形態(tài)學(xué)特征.

1.3 藻種的同源性分析

參照Gan et al[15]方法提取MEM25的基因組DNA并進(jìn)行18S rRNA的PCR擴(kuò)增,取2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),余液置于4 ℃保存,之后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序后獲得的18S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多重序列比對(duì),與NCBI上已有的序列進(jìn)行相似性比較分析,從而確定該藻株的種屬.

1.4 藻種的耐受性試驗(yàn)

1.4.1 鹽度對(duì)藻種生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)一段時(shí)間后的MEM25和IMET1離心收集,取藻泥分別接種于鹽度為1.8 %、3.5 %、7.0 %、10.5 %的無(wú)菌F2液體培養(yǎng)基,置于溫度25 ℃、光強(qiáng)50 μmol·m-2·s-1、在光照時(shí)間24 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于2、4、6、8 d測(cè)定各試驗(yàn)組的D750 nm；于0、1、3、6、12、24、48、96 h測(cè)定1.8 %、7.0 %組的Fv/Fm.

1.4.2 光照對(duì)藻種生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)一段時(shí)間后的MEM25和IMET1離心收集,取藻泥接種于無(wú)菌F2液體培養(yǎng)基,置于溫度25 ℃、每天光照時(shí)間為24 h、光強(qiáng)分別為50和200 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于2、4、6、8 d測(cè)定各試驗(yàn)組的D750 nm；于0、1、3、6、12、24、48、96 h測(cè)定200 μmol·m-2·s-1組的Fv/Fm.

1.4.3 溫度對(duì)藻種生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)一段時(shí)間后的MEM25和IMET1離心收集,取藻泥接種于無(wú)菌F2液體培養(yǎng)基,置于光強(qiáng)50 μmol·m-2·s-1,光照時(shí)間為24 h、溫度分別為15、25、28、35 ℃的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),于 2、4、6、8 d測(cè)定各試驗(yàn)組的D750 nm；于0、1、3、6、12、24、48、96 h測(cè)定15、35 ℃組的Fv/Fm.

1.5 藻種的模擬戶外培養(yǎng)

在室內(nèi)模擬海南的戶外環(huán)境,采用容積為100 mL的立柱式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)MEM25和IMET1,培養(yǎng)過(guò)程中全程給予鹽度為7.0 %、溫度為30～34 ℃、光照為250～350 μmol·m-2·s-1的條件.10 d后收集藻樣本,參照Wu et al[16]的方法測(cè)定細(xì)胞干重和蛋白質(zhì)含量,按照Xin et al[17]方法測(cè)定脂肪酸.

1.6 藻種的戶外養(yǎng)殖

將小球藻MEM25接種于體積為500 L的管道式戶外光生物反應(yīng)器,初始接種密度為0.5×107個(gè)·mL-1,共培養(yǎng)7 d,期間每天進(jìn)行顯微鏡觀察并做細(xì)胞計(jì)數(shù).細(xì)胞計(jì)數(shù)方法為：藻細(xì)胞密度(個(gè)·mL-1)=N/5×25×104×稀釋倍數(shù).其中：N代表5個(gè)中方格的細(xì)胞總數(shù)；N/5是計(jì)算每個(gè)中方格的平均細(xì)胞數(shù)量；N/5×25是計(jì)算中央大方格細(xì)胞總數(shù)；N/5×25×104是1 mL體積中的細(xì)胞個(gè)數(shù).細(xì)胞的日增長(zhǎng)量用μ=Ny-Nx/ty-tx來(lái)計(jì)算,其中Nx和Ny分別是細(xì)胞在tx和ty時(shí)的細(xì)胞數(shù).

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013版本進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)平板劃線培養(yǎng)后(圖1)，MEM25呈現(xiàn)綠色、半濕潤(rùn)、凸起狀藻落,挑取該藻株接種于液體F2培養(yǎng)基,培養(yǎng)2周后形成綠色藻液,顯微觀察結(jié)果顯示該藻株的細(xì)胞呈球形,直徑約為2～8 μm,無(wú)鞭毛.

a.MEM25的菌落形態(tài);b.MEM25的顯微特征.圖1 MEM25的菌落形態(tài)和顯微特征Fig.1 Morphological characteristics of MEM25

2.2 同源性分析

將MEM25的18S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(MF737085)進(jìn)行多重序列比對(duì),與已有效發(fā)表的藻株進(jìn)行序列相似性分析,發(fā)現(xiàn)其與小球藻屬模式藻株Chlorellavulgaris的序列相似性最高(98.0%).

2.3 耐受性試驗(yàn)

2.3.1 MEM25對(duì)高鹽的耐受性 如圖2所示，MEM25在4種鹽濃度條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)都呈上升趨勢(shì),且在7.0 %鹽度條件下的生物量最高,第8天時(shí)D750 nm為3.66,與初始相比增長(zhǎng)12.2倍；在105‰鹽度條件下的生物量最小,第8天時(shí)D750 nm為2.095,與初始相比仍增長(zhǎng)了6.93倍.IMET1在1.8 %、3.5 %、7.0 %下均呈上升趨勢(shì),且在3.5 %鹽度條件下的生物量最大,第8天時(shí)的D750 nm為2.02,較初始值增長(zhǎng)了6.73倍；但是IMET1在10.5 %鹽濃度條件下的生長(zhǎng)明顯受到過(guò)高鹽度的抑制,第8天的D750 nm為0.45,生物量?jī)H增長(zhǎng)1.3倍.在1.8 %、3.5 %、7.0 %條件下,MEM25的生物量比IMET1均高出約2倍；在10.5 %鹽濃度條件,MEM25的生物量是IMET1的4.65倍,且MEM25的Fv/Fm始終比IMET1高.因此較IMET1而言,MEM25對(duì)于鹽度的耐受范圍更寬、耐受能力更強(qiáng).

2.3.2 MEM25對(duì)高光的耐受性 如圖3所示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,MEM25在兩種條件下的生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)出上升趨勢(shì),在高光照250 μmol·m-2·s-1條件下的D750 nm達(dá)到最大,較初始相比增長(zhǎng)了5.26倍；而IMET1的生長(zhǎng)趨勢(shì)在兩種條件下均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),僅在低光照50 μmol·m-2·s-1條件下達(dá)到最大D750 nm.無(wú)論是50 μmol·m-2·s-1還是250 μmol·m-2·s-1條件下,MEM25的D750 nm均顯著高于IMET1.在250 μmol·m-2·s-1條件下,MEM25的Fv/Fm始終比IMET1高,說(shuō)明MEM25對(duì)高光具有更強(qiáng)的耐受能力.值得注意的是,試驗(yàn)中二者的Fv/Fm都表現(xiàn)為先降后升、之后再下降的趨勢(shì),這說(shuō)明在高光條件下二者都受到脅迫,但藻株自身對(duì)于脅迫條件會(huì)逐步進(jìn)行自我調(diào)整,且MEM25的自適應(yīng)能力更強(qiáng).

圖2 不同鹽度下MEM25與IMET1的D750 nm和Fv/FmFig.2 D750 nm and Fv/Fm values of strains MEM25 and IMET1 under different saline conditions

圖3 不同光強(qiáng)下MEM25與IMET1的D750 nm和Fv/FmFig.3 D750 nm and Fv/Fm of MEM25 and IMET1 in different illumination

2.3.3 MEM25對(duì)高溫的耐受性 如圖4所示,在4種溫度條件下,MEM25的D750 nm均隨著時(shí)間的增加而逐步增加,在35 ℃條件下達(dá)到最大值,與初始濃度相比增長(zhǎng)了10.6倍.IMET1的生長(zhǎng)趨勢(shì)則與MEM25相反,在15 ℃條件下IMET1擁有最大D750 nm,與初始時(shí)相比增長(zhǎng)了8.9倍,但隨溫度升高,IMET1的生長(zhǎng)開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì).在35 ℃條件下MEM25的D750 nm達(dá)到最大,而此時(shí)的IMET1因受到高溫脅迫導(dǎo)致死亡.隨著時(shí)間推移,二者的Fv/Fm都呈逐步下降趨勢(shì),但I(xiàn)MET1比MEM25的Fv/Fm更低,特別是從第48 h開始IMET1的Fv/Fm已降到0,說(shuō)明藻株已經(jīng)死亡.因此較IMET1而言,MEM25對(duì)于高溫的耐受能力更強(qiáng).

圖4 不同溫度下MEM25與IMET1的D750 nm和Fv/FmFig.4 D750 nm and Fv/Fm of MEM25 and IMET1 in different illumination

2.4 模擬戶外條件培養(yǎng)MEM25

在室內(nèi)模擬海南的戶外環(huán)境條件培養(yǎng)MEM25和IMET1,藻液隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而顏色逐漸變深,且MEM25的顏色比IMET1的顏色更深.在第10天收集樣本測(cè)定二者的干重和蛋白質(zhì),結(jié)果如圖5所示,MEM25和IMET1的干重分別為1.88和0.73 g·L-1,MEM25的干重是IMET1的2.58倍；MEM25和IMET1的蛋白質(zhì)含量分別為53%和32%,MEM25的蛋白質(zhì)含量是IMET1的1.66倍.與IMET1相比,MEM25在模擬戶外培養(yǎng)條件下不僅能保持良好的生長(zhǎng)趨勢(shì),還能大量積累干物質(zhì)和蛋白質(zhì),具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.

圖5 MEM25與IMET1的干重和蛋白質(zhì)含量Fig.5 Dry weight and protein of MEM25 and IMET1

圖6 MEM25的戶外生長(zhǎng)情況Fig.6 Growth of MEM25 outdoor

2.5 戶外培養(yǎng)MEM25

將小球藻MEM25采用戶外光生物反應(yīng)器共培養(yǎng)7 d,結(jié)果如圖6所示,小球藻MEM25的細(xì)胞濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增長(zhǎng),在第8天采收時(shí)的細(xì)胞濃度達(dá)到最高值12.65×107個(gè)·mL-1,是初始接種濃度的25倍.從細(xì)胞的日增長(zhǎng)量上看,其規(guī)律呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),其中最大日增長(zhǎng)量為3.31×107個(gè)·mL-1.收集第8天的小球藻MEM25樣本用于測(cè)定氨基酸和脂肪酸的含量(圖7),可以看到小球藻MEM25的氨基酸種類齊全且必需氨基酸含量豐富,其中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的49.5%；此外小球藻MEM25的不飽和脂肪酸占比大,特別是必需脂肪酸C18∶2和C18∶3的含量分別為30.9%和34.7%.綜合以上來(lái)看,利用戶外的光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的小球藻MEM25不僅生長(zhǎng)迅速而且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.

圖7 MEM25的氨基酸和脂肪酸含量Fig.7 Amino acid and fat acid of MEM25

3 討論

目前用于規(guī)模生產(chǎn)的微藻種類主要包括螺旋藻、小球藻、雨生紅球藻、杜氏鹽藻、三角褐脂藻等[18-21].通常在試驗(yàn)室條件下,各種微藻的生長(zhǎng)速率和生物量都能夠達(dá)到最佳狀態(tài)[22]；然而在規(guī)模化培養(yǎng)過(guò)程中,由于環(huán)境條件的改變導(dǎo)致藻種的生長(zhǎng)速率降低、抗逆性下降,最終導(dǎo)致減產(chǎn)[23],因此如何提高微藻的規(guī)?；B(yǎng)殖效率是當(dāng)前微藻產(chǎn)業(yè)中的重要議題.影響微藻規(guī)模化養(yǎng)殖的因素主要有藻種、培養(yǎng)條件和光生物反應(yīng)器等方面[24],其中藻種的繁殖能力、抗逆性和營(yíng)養(yǎng)多樣性對(duì)規(guī)模養(yǎng)殖效率有著直接的影響[25],比如有學(xué)者從沼液中篩選到一株耐污性較強(qiáng)的小球藻,將其實(shí)現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖后并采收,檢測(cè)其蛋白質(zhì)含量達(dá)62.56%,表明該藻株具有作為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料的潛力[26]；Andreas篩選出嗜鹽性扁藻TetraselmisMUR-167并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖,該藻株在養(yǎng)殖過(guò)程中不僅能產(chǎn)生較高的油脂量,還具有突出的耐污染特性[27].然而并不是所有的藻種都適合規(guī)?；娜斯づ囵B(yǎng),在實(shí)踐中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)很多藻種在規(guī)?；囵B(yǎng)中會(huì)出現(xiàn)各種問題,比如Sing在戶外規(guī)模培養(yǎng)硅藻Amphorasp.過(guò)程中由于扁藻Tetraselmissp.污染了培養(yǎng)體系而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗[28]；Moheimani在培養(yǎng)顆石藻Pleurochrysiscarterae時(shí)遇到暴雨天氣,致使培養(yǎng)液鹽度驟降,從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗[29].由此可以看出微藻種質(zhì)資源對(duì)于微藻生物技術(shù)的發(fā)展來(lái)講十分重要,藻種性狀是否優(yōu)良會(huì)對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖效率和產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生直接影響,只有具備寬泛的環(huán)境適應(yīng)性和耐受性的藻種才更適用于規(guī)模養(yǎng)殖.因此,不斷地篩選、更新藻種是推動(dòng)微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要工作之一,本試驗(yàn)中所篩選到的小球藻MEM25與IMET1相比擁有高效的生長(zhǎng)速率和卓越的環(huán)境耐受性并在戶外能夠?qū)崿F(xiàn)高效率養(yǎng)殖.基于本試驗(yàn)結(jié)果,未來(lái)將針對(duì)MEM25開展進(jìn)一步的戶外規(guī)?；B(yǎng)殖和應(yīng)用試驗(yàn).