高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量方法的比較研究

司舒杰，魏穎軒

（1 內蒙古第四醫(yī)院，內蒙古 呼和浩特；2 內蒙古包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內蒙古 包頭）

0 引言

《中國藥典》2015 版一部載有黃芪藥材及飲片，其在臨床應用廣泛，同時也作為保健食品深受市場歡迎。因此，黃芪的質量控制顯得尤為重要。在本次對毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定時發(fā)現(xiàn)，按照乙腈-0.2%甲酸（20：80）為流動相，檢測波長260nm，檢測時間可以縮短至30min甚至更短，并且避免了藥典方法中由于梯度洗脫造成的明顯雜峰和基線不穩(wěn)定的情況，根據以上發(fā)現(xiàn)，對36 批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定，并與藥典方法的含量結果進行對比。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A 高效液相色譜儀（紫外檢測器）。Thermo Ultiamate3000 高效液相色譜儀。萬分之一天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司,AL204-IC]。十萬分之一天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司,BP-211D]。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品批號：111920-201606，純度：97.6%（來源：中國食品藥品檢定研究院）；樣品以黃芪飲片為主，共34 批次（占94.44%）；黃芪藥材2 批次（占5.56%）。標示生產企業(yè)27 家，覆蓋9 個省市自治區(qū)，其中河北省10 家，內蒙古自治區(qū)6 家，安徽省3 家，北京市和甘肅省各2 家，陜西省、四川省、廣東省和黑龍江省各1 家；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

藥典方法：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；以乙腈為流動相A，以0.2%甲酸溶液為流動相B，按表1 中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速 1.0ml/min；檢測波長 260nm；柱溫 30℃；進樣量10μl。見表1。

表1 洗脫條件

新方法：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相為乙腈-0.2% 甲酸溶液（20：80），流速1.0ml/min；檢測波長260nm；柱溫30℃；進樣量10μl。

2.2 溶液制備

對照品溶液的制備：稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品13.34mg，精密稱定，置25ml 量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，再取1ml，置10ml 量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，制成每1ml含52.08μg 的對照品溶液。

供試品溶液的制備：兩種方法均按《中國藥典》2015年版一部黃芪項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的方法制備供試品溶液[1]。

2.3 兩種方法測定結果比較

2.3.1 圖譜的比較

分析圖譜結果得出藥典方法進行梯度洗脫時，在35min 之后有明顯的雜峰和基線不平穩(wěn)的現(xiàn)象，在基線、空白、標準品和對照品的譜圖中均出現(xiàn)，說明并非樣品的雜峰，而是梯度洗脫造成的影響，而在改進條件下可見，基線平穩(wěn)，且可將采集時間減少至30min 甚至更短；并且在樣品色譜圖中可見主峰附近雜峰也較多，雜峰與主峰間分離度有時達不到要求，而在改進條件下可見基線較平穩(wěn)，主峰周圍雜峰也較少。

2.3.2 含量測定結果的比較

兩種方法的含量測定結果對比發(fā)現(xiàn)，8 組數(shù)據藥典方法的含量高于新方法的含量，占總樣品量的22.2%，28組數(shù)據新方法的含量高于藥典方法含量，占總樣品量的77.8%。結果見表2。

表2 兩種方法測得的樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

3 新方法的方法學考察

3.1 純度試驗

將毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品及供試品溶液在DAD檢測器下做全波長掃描，測得樣品峰與對照品峰的吸收光譜形狀一致，峰純度符合要求，說明其為同一物質。

3.2 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，室溫下分別于放置0h、2h、4h、8h、12h、24h 進行測定，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷在24h之內峰面積積分值基本穩(wěn)定不變。RSD 為0.2%（n=6），表明室溫下供試品溶液放置24h 內穩(wěn)定。

3.3 精密度試驗

取同一供試品溶液10μl，按新方法色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定峰面積。結果RSD 為0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.4 線性關系考察

精密吸取配制好的對照品溶液2μl、4μl、8μl、10μl、16μl、20μl 分別進樣。以峰面積A 為縱坐標、以毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣量X(μg)為橫坐標，繪制標準曲線。毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣量在0.10416-1.0416μg范圍內線性關系良好?；貧w方程為Y=2903675X+63116，R2=1。

3.5 加樣回收試驗

精密稱定6 份已知含量的黃芪藥粉約1g，置圓底燒瓶中，精密加入500μg 的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，精密加入甲醇50ml，按照供試品溶液制備方法操作，并測定含量，計算回收率。平均回收率為97.0%，RSD0.7%。

4 討論

在對黃芪藥材及飲片的含量測定時，其項下的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定過程中發(fā)現(xiàn)主峰與周圍雜峰分離效果差，達不到藥典要求的分離度，在查閱了大量有關毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的文獻方法[2-8]后，通過總結發(fā)現(xiàn)文獻多采用梯度洗脫的方法進行試驗，經過驗證梯度洗脫方法對于黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離效果欠佳，并且雜峰較多，基線不穩(wěn)。因此，本試驗嘗試優(yōu)化HPLC色譜條件并建立HPLC 測定黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的方法。

本試驗以藥典中“黃芪”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜條件為基礎，優(yōu)化HPLC 色譜條件。檢測時間可以縮短至30min，并且避免了藥典方法中由于梯度洗脫造成的明顯雜峰和基線不穩(wěn)定的情況，根據以上發(fā)現(xiàn)，對36 批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定，并與藥典方法的含量結果進行對比。新方法所測的結果普遍比藥典方法高，并且36 批樣品的平均值也高于藥典方法。

因此，筆者對建立的方法，以精密度、重復性、回收率等為考察指標，進行了方法學的考察，發(fā)現(xiàn)該含量測定方法可靠、重現(xiàn)性好，且具有一定的適用性。